PENGEMBANGAN & VALIDASI METODE

ANALISIS TERHADAP PENENTUAN

KADAR OBAT DALAM SEDIAAN
FARMASI DENGAN METODE KCKT & GC
Dosen: Lia Puspitasari, S.Farm, M.Si, Apt

KELOMPOK 3

Arlya Mahayani Putri 18330082

Nuri Destia Murdiani 18330089
Rahmawati Nuraeni 18330095
Annisa Rahman 18330096
Ella 18330101
Ai Nurul Azizah 18330104
Sela Luciana 19330707
 LATAR BELAKANG
Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.

Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan :

1. kecermatan (akurasi)

2. keseksamaan (presisi)

3. selektivitas, linearitas dan rentang

4. batas deteksi(LOD) dan batas kuantitas (LOQ)

5. ketangguhan metode, kekuatan metode

 KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

• Kromatografi cair berperforma tinggi merupakan

salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang
biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
• Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC
berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu
 PRINSIP KERJA KCKT

• Teknik yang dimana solute atau zat terlarut terpisah

perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-
solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solute-solut ini diatur oleh distribusi
solute dalam fase gerak dan fase diam
CONTOH METODE ANALISIS DALAM
JURNAL

• Validasi metode analisis untuk obat amoxicilin

• Berdasarkan Food and Drug Administration (FDA), salah satu

obat yang wajib di uji bioekuivalensinya adalah amoxicilin.

• Penelitian bertujuan untuk melakukan pengembangan dan

validasi dalam bahan baku obat dan sediaan farmasi

amoxicilin menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi.

 ALAT:

KCKT dengan detektor UV 230 nm Kolom symmetry C18 (15 cm x spektrofotometer UV-Vis tabung
(Shimadzu). 4,6 mm; ukuran partikel 5 μm). (Shimadzu UV 1800). Sentrifugator.
sentrifuge.

mikropipet 100
timbangan analitik. pH meter. blue tip. Rak dan tabung lemari pendingin.
dan 1000 μL.
reaksi.
 ALAT DAN BAHAN
BAHAN:
• Zat aktif amoxicillin.
1

• Metanol HPLC.
2

• Metanol (P.A).
3

4 • Buffer kalium dihidrogen fosfat (pH diatur 5,0 dengan asam fosfat)

5
• NaOH.

6 • Larutan EDTA.

7 • Aqua bidestillata

• Plasma darah
8
 CARA KERJA

Pembuatan Larutan Induk Amoxicilin

Optimasi waktu (Operaiting time) untuk Analisis

Pembuatan Dapar Fosfat

Penetapan Fase Gerak

 VALIDASI METODE ANALISIS
AMOXICILLIN

• Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas

Larutan Sampel
dengan
konsentrasi 3, 6,
Setelah itu dibuat
9, 12 dan 15 Dihitung
kurva kalibrasi
μg/mL Sebanyak koefisien korelasi
dengan
20 μL larutan (r) dari kurva
persamaan garis
tersebut tersebut
linear (y=a+bx)
disuntikkan ke
alat KCKT pada
kondisi terpilih
 Tujuan VMA
• Tujuan dari pelaksanaan Validasi Metode Analisa (VMA)

adalah untuk menunjukkan bahwa semua metode tetap

yang digunakan sesuai dengan tujuan penggunaannya dan

selalu memberikan hasil yang dapat dipercaya

• Jadi, dalam Validasi metode analisa yang diuji atau

divalidasi adalah PROTAP (prosedur tetap) pengujian dari

amoksisilin.
Hasil VMA
- Uji Linearitas

Uji ini dilakukan pada seri larutan standar Amoxicilin

dengan empat konsentrasi yaitu 3, 6, 9, dan 12 µg/mL.
Dari uji ini diperoleh persamaan regresi liniear dan
koefisien korelasi (r). Hasil uji ini diperoleh persamaan y
= 853835X - 990947 dan koefisien korelasi (r) 0,9409
2. Uji presisi
Dilakukan intra-hari dan inter-hari, pada pengujian
intra-hari, konsentrasi yang digunakan yaitu 3 µg/mL
diperoleh %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar
0,32%, pada konsentrasi 6 µg/mL sebesar 0,85% dan
konsentrasi 9 µg/mL diperoleh 0,06%. Sedangkan pada
pengujian inter-hari %RSD (Relative Standard
Deviation) yang diperoleh dari konsentrasi 3 µg/mL
yaitu 2,63%, konsentrasi 6 µg/mL yaitu 1,15% dan 9
µg/mL yaitu 1,56%.
Terlihat dari kedua data intra-hari dan inter-hari selama 2
hari berturut-turut hasil %RSD (Relative Standard
Deviation) ≤ 15 %. Hasil ini sesuai dengan teori yang
mengatakan bahwa untuk senyawa-senyawa dengan
pengukuran kadar sekelumit, nilai %RSD dapat diterima
jika ≤ 15% (Gandjar & Rohman, 2007). sehingga bisa
dikatakan pada uji presisi ini memenuhi syarat. Uji ini
dilakukan intrahari dan inter hari selama 2 hari untuk
memastikan bahwa setelah sediaan disimpan masih stabil
dan tidak mengganggu hasil analisa.
3. Batas Deteksi dan Batas Kuantitas Batas

Hasil dari uji batas deteksi ini adalah 2,5 µg/mL

dan batas kuantitasi sebesar 8,36. Sehingga bisa
dikatakan bahwa amoxicilin tidak akan terbaca
lagi pada konsentrasi di bawah 2,50 µg/mL dan
hasil tersebut terbukti.
4. Uji Kesesuaian Sistem
Uji Kesesuaian Sistem Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk

memastikan kesesuaian dan keefektifan sistem yang digunakan

agar diperoleh kondisi oprasional dan kromatogram yang baik.

Dari hasil percobaan diperoleh nilai rata-rata, yaitu jumlah

plat teoritis 18,19, faktor kapasitas 4,71, asimetris 0,70 dan

%RSD (standar deviasi relatif) 15,35%.

Lanjutan...
Berdasarkan hasil tersebut ada beberapa parameter
yang tidak sesuai dengan persyaratan yaitu untuk plat
teoritis yang dipersyaratkan >2500 sedangkan
hasilnya 15,35%. Namun untuk faktor kapasistas dan
faktor tailing (asimetris) telah sesuai. Ketidak
sesuaian hasil plat teoritis disebabkan oleh perubahan
HETP (lebar lempeng teoritis) dan juga pelebaran.
5. Penetapan Kadar Amoxicilin dalam
plasma Darah
Pada penetapan kadar amoxicilin dalam plasma digunakan satu

sampel darah yang diambil plasmanya kemudian dengan

menggunakan dua konsentrasi yaitu konsentrasi 250 µg/mL dan

500 µg/mL. Dari setiap konsentrasi dilakukan pengulangan tiga

kali. Untuk konsentrasi 250 µg/mL dihasilkan rata2 puncak

441847,33, rata-rata waktu retensi 2,76 dan rata-rata kadar

terukurnya 1,67. Sedangkan untuk konsentrasi 500 µg/mL rata-rata

luas puncaknya 2069980,33, waktu retensinya 2,71 dan kadar

terukurnya 3,88.
 Lanjutan...
• Dari kedua konsentrasi tersebut terlihat bahwa pada konsentrasi

250 µg/mL nilai kadar terukur kurang dari LOD (2,50 µg/mL)

sehingga pada konsentrasi tersebut tidak dapat terdeteksi

sedangkan pada konsentrasi 500 µg/mL nilai kadar terukurnya

lebih besar dari nilai LOD (2,50 µg/mL) sehingga dapat dikatakan

pada konsentrasi tersebut amoxicilin dapat terdeteksi. Kadar

amoxicilin yang terukur dalam plasma sangat sedikit, ini berarti

amoxicilin memiliki biovailabilitas yang sangat kecil dalam

plasma sehingga konsentrasi yang digunakan harus tepat.

METODE KROMATOGRAFI GAS

BAHAN INSTRUMEN PENGUMPULAN

PENELITIAN PENELITIAN DATA
 ALAT DAN BAHAN
• Alat
1. alat-alat gelas yang umum digunakan dalam laboratorium analisis
2. box es, pipet mikro dengan ukuran 1000 μL (200-1000 μL) dan 20 μL (2-20 μL)
3. neraca analitik
4. gunting stainless steel
5. wadah plastik bertutup
6. Gas Chromatography (GC) tipe Agilent 6890N dengan kolom kapiler HP-5ms
(30 m x 0,25 mm x 0,25 μm)
7. detektor Mass Spectrometry (MS) tipe Agilent 5973.

• Bahan
1. Spesimen yang digunakan dalam penelitian ini adalah rambut.
2. Diklorometana (CH2Cl2), metanol (CH3OH)
3. Standar pembanding acetaminophen dan N,O-bis (trimetilsilil)
trifluoroasetamida (BSTFA) yang mengandung trimetilklorosilan (TMCS) 1%
yang diperoleh dari Sigma Aldrich Chemical Singapore.
 CARA KERJA

Preparasi Larutan Standar Parasetamol

Ekstraksi spesimen rambut simulasi

Preparasi dan analisis spesimen rambut

Cara Pengolahan dan Analisis Data

CONTOH METODE ANALISIS DALAM
JURNAL

• Validasi metode analisis untuk obat acetaminophen

• Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah
senyawa acetaminophen dapat terdeteksi pada
spesimen rambut pasien yang mendapatkan terapi
parasetamol serta mengetahui pengaruh panjang
spesimen rambut terhadap konsentrasi acetaminophen
pada spesimen rambut manusia.
 VALIDASI METODE ANALISIS
• 
1. Linieritas

Uji linieritas dilakukan dengan cara membuat persamaan regresi linier berdasarkan

konsentrasi dan area, dengan

rumus : y = bx + a

dengan, y = luas puncak (peak area)

x = konsentrasi zat kemudian dihitung harga koefisien korelasi.

• Penentuan batas deteksi (LoD) dan batas kuantitasi (LoQ)

• Untuk menentukan LoD dan LoQ dapat digunakan rumus :

• LOD = S(y/x) = LOQ =

Lanjutan.....
•• Akurasi
  (persen recovery)
Untuk menentukan akurasi maka dilakukan perhitungan persen recovery
atau perolehan kembali menggunakan ekstrak cair spesimen rambut
simulasi. Digunakan rumus nilai recovery:
Recovery = x 100%
• Presisi
Presisi diperoleh dengan menginjeksikan masing-masing standar
acetaminophen sebanyak 3 (tiga) kali, kemudian dihitung nilai presisi
berdasarkan harga koefisien variasi, dengan rumus :
CV =
dengan,
Sb : simpangan baku relatif
X : harga rata-rata dari banyaknya pengukuran
HASIL VALIDASI METODE ANALISIS

a. Validasi metode penelitian

Berdasarkan hasil analisis terlihat bahwa pada blanko tidak
ditemukan puncak yang merupakan senyawa acetaminophen,
sedangkan pada larutan standar terkonsenrasi menunjukkan
puncak senyawa acetaminophen dalam bentuk derivatnya
yakni acetaminophen-TMS pada waktu retensi 18.10 pada
mode Full Scan dan 18.09 pada mode SIM (Selected Ion
Monitoring).
b. Pengaruh Perlakuan Derivatisasi Terhadap Hasil
Pengukuran Larutan Standar Acetaminophen

Pada larutan standar acetaminophen 20 ppm yang diinjeksikan ke

dalam sistem GC-MS dengan perlakuan derivatisasi, diperoleh hanya
1 puncak untuk senyawa acetaminophen, yakni dalam bentuk
acetaminophen-TMS. Acetaminophen-TMS (C11H17NO2Si)
merupakan derivat acetaminophen akibat pergantian gugus H dengan
Trimetilsilil (Si (CH3)3) pada molekul NH. Perubahan senyawa
menyebabkan terjadinya perubahan berat molekul (BM). Senyawa
acetaminophen-TMS memiliki BM 223.34 g/mol dengan ion
fragmentasi yang memiliki kelimpahan tertinggi antara lain : 166, 181,
dan 223.
c. Analisis senyawa acetaminophen pada spesimen rambut

• Analisis dilakukan pada 10 sukarelawan yang mendapatkan terapi

acetaminophen kemudian diambil spesimen rambutnya pada

panjang 0-3 cm, 0-6cm dan 0-10 cm untuk dianalisis. Dari 10 orang

subyek penelitian, 2 diantaranya tidak terdeteksi senyawa

acetaminophen, sedangkan 8 lainnya terdeteksi senyawa

acetaminophen dalam bentuk acetaminophen-TMS. Sebagai

pembanding maka digunakan sampel blanko yang diperoleh dari

sukarelawan yang tidak mendapatkan terapi acetaminophen dan

dibuat larutan standar acetaminophen dengan konsentrasi tertentu.

d. Pengaruh panjang spesimen rambut terhadap
konsentrasi acetaminophen pada spesimen rambut

• hasil uji regresi linier sederhana diperoleh nilai r = 0.535 yang

menunjukkan bahwa 53.5% dari varians konsentrasi senyawa
acetaminophen dapat dijelaskan oleh perubahan dalam variabel
panjang spesimen rambut sedangkan 46.5% sisanya dijelaskan
oleh faktor di luar model. Diperoleh persamaaan : Y = 0.202 +
0.019 X + edengan nilai probabilitas (nilai signifikan) adalah
0,007.
 DAFTAR PUSTAKA
• Komang A.G.D., Achmad B, Ni Made S.2016, PENGEMBANGAN METODE GC-MS UNTUK PENETAPAN KADAR
ACETAMINOPHEN PADA SPESIMEN RAMBUT MANUSIA, Jurnal Biosains Pascasarjana Vol. 18, Universitas Airlangga,
Indonesia
• Ahmed, M., G.Babu, S., A.Sathish, K, S. 2011. Development and Validation of Amoxicillin by RP-HPLC Method in Bulk drug
and Pharmaceutical dosage forms. International Journal of ChemTech Research. IJCRGG, CODEN(USA). Vol. 3, No.3, pp
1037-1041.
• Depkes RI.1984. Farmakope Indonesia. Edisi III. Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Halaman 9, 31, 902.
• Dhoka, M., Gawande, V., Joshi, P. 2010. High performance Liquid Chromatographic Method For Determination Of Amoxicilin
Trihydrate and Bromhexine Hydrochloride In Oral Dosage Forms. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Science. 2 : 129-133.
• Dirjen POM Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia, Edisi IV. Departemen Kesehatan
Republik Indonesia. Jakarta. Hal :1083, 1084.
• Gandjar, G.I., Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
• Harahap, Y. 2008. Validasi Metode Analisis Cilostazol dalam Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi . Jurnal
Program Sarjana Farmasi. Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta. Hal:09-20.
• Hermita. 2004. Metode Penetapan Kadar Meloxicam dalam Darah Manusia In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .
Jurnal Program Sarjana Farmasi. Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta. Hal:79-92.
• Johnson, E.L., Stevenson; R. 1978. Basic liquid chromatography. Varian, California.
• Kelly MT. 1990. Drug Analysis in Biological Fluids. Chemical Analysis in Complex Matrices. Dublin, Ireland. Hal.17-97.
• Lestari Dewi. 2008. Validasi Metode Analisis Levofloksasin dalam Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Fluoresensi. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam UI, Depok.
• Martina Alfan.2009. Optimasi Fase Gerak Dapar Fosfat PH 4,4- Metanol Pada Penetapan Kadar Campuran Amoksisilin dan
Kalium Klavulanat dalam Tablet Secara Simultan dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) . Skripsi. USU, Medan.
• Shargel, Leon; Andrew B.C.Yu. 1941. Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, Third edition. Appleton, Lange. Hal:
33-110.
• Sudjadi dan Rohman. 2012. Analisis Farmasi. Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
TERIMAKASIH...