HPLC

Dr. H. ATIKAH, MSi.Apt

PRODI FARMASI FKUB-2013

HPLC
High Performance Liquid Chromatography High Pressure Liquid Chromatography Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Atau dapat disingkat LC

Chromatography teknik pemisahan Liquid Fase gerak berupa cairan High Pressure digunakan tekanan tinggi
untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom

HPLC
Dikembangkan pada awal 1970-an Dewasa ini merupakan teknik paling banyak digunakan untuk pemisahan dan analisis dari berbagai bidang seperti farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer dan makanan. Merupakan method of choice for the analysis of a wide variety compounds

Keunggulan dan Kelemahan HPLC

Keunggulan
Dilakukan pada suhu kamar Analisis kuantitatif yang cepat dengan presisi dan akurasi yang tinggi Dapat dioperasikan secara otomatis Sensitivitas detektor yang tinggi Dapat diaplikasikan untuk berbagai analit dalam jenis sampel yang lebih luas

Kelemahan
Sulit ditemukan detektor yang universal Efisiensi pemisahan lebih rendah daripada GC Lebih rumit dalam pelaksanaannya Lebih mahal

Klasifikasi HPLC Berdasarkan Mekanisme

Kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography) Kromatografi Partisi (partition chromatography) Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange Chromatography) Size exclusion chromatography (SEC) Kromatografi Permeasi Gel Kromatografi Filtrasi Gel

CHROMATOGRAPHY

GAS

SFC

LIQUID

GSC

GLC

Column

Planar

NP

RP

IEC

SEC

TLC

Paper

GPC

GFC

Fase normal dan Fase terbalik

Normal Phase (Fase normal)
Fase diam polar dan fase gerak non polar Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana dll.

Reversed Phase (Fase terbalik)

Fase diam non polar dan fase gerak polar

Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril dll.

Kromatografi Fase Normal

Disebut juga kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography) Pemisahan didasarkan atas adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam polar (silika atau alumina) Analit polar lebih tertahan daripada analit non polar karena gugus silanol pada silika.

Kromatografi Fase terbalik

Pemisahan didasarkan atas koefisien partisi analit dalam fase diam dan fase gerak Urutan elusi: analit polar terelusi lebih dahulu, analit non plar terelusi terakhir Cocok untuk analisis zat-zat yang larut dalam air, semipolar atau beberapa senyawa non polar. Untuk analit berupa ion dapat dianalisis dengan RP-HPLC menggunakan dapar dan teknik pasangan ion (ion-pair).

Ion Exchange Chromatography

Pemisahan didasarkan atas pertukaran ion analit dengan ion dari gugus fungsi bahan pendukung padat fase diam Contoh Fase diam: senyawa sulfonate (penukar kation); ammonium kuarterner (penukar anion) Fase gerak: dapar Aplikasi: analisis ion, asamasam amino, protein/peptida, polinukleotida

Size Exclusion Chromatography

Untuk pemisahan makromolekul (BM > 10000). Disebut GFC jika digunakan untuk pemisahan molekul biologis yang larut air Disebut GPC jika digunakan untuk penentuan Bobot molekul suatu polimer organik. Fase gerak umumnya toluen dan tetrahidrofuran.

Modus Pemisahan Lainnya

Kromatografi afinitas (Affinity chromatography) pemisahan berdasarkan interaksi reseptor/ligand dengan komponen analit. Ligand dalam bentuk enzim, antigen atau hormon yang diikatkan pada bahan pendukung padat. Chiral chromatography untuk senyawa chiral Hydrophillic interaction chromatography (HILIC) mirip NP-HPLC yang menggunakan fase diam polar tetapi dielusi dengan fase gerak polar.

Instrumentation

Gradient Controller

Pump
Mobile Phases

Column
Detector Injector

Instrumentation

Instrumentation
Degasser
70 mbar A B C A B C

Pump

A B C Eluent

Gradient mixer Column

Detector

Instrumentation

Fase Gerak
Fase gerak diletakkan dalam botol-botol reservoir.

Fase Gerak
Zat cair yang digunakan sebagai fase gerak harus saling campur.

HPLC Mobile Phase

High solubility for the sample components Non corrosive to HPLC system components High purity, low cost, UV transparency Others: low viscosity, low toxicity, non flammability

Reversed-phase mobile phases

Water Methanol Acetonitrile THF Additives, salts, acids, bases Ion pairing

Kemurnian Fase gerak

Diperlukan solvent dengan kemurnian tinggi Adanya pengotor (impurities) pada solvent dapat menimbulkan gangguan analisis. Gunakan HPLC grade Air sebagai fase gerak: digunakan water for injection
Solvent Acetonitrile Water Cyclohexane Hexane Methanol Ethanol Diethyl Ether Dichloromethane Chloroform Carbon Tetrachloride Tetrahydrofuran Toluene UV Cutoff (nm) 190 190 195 200 210 210 220 220 240 265 280 (220) 285

Isocratic and Gradient Elution

Isocratic elution:
Constant mobile phase composition during run

Gradient elution:
Programme a changing (stepwise or continuous) mobile phase composition during the run For more complex mixtures

Gradient Analysis
Advantages: Better suited for complex samples Better resolution of early and late eluting peaks Better sensitivity of late eluting peaks Higher peak capacity (fit more peaks in the chromatogram) Disadvantages More complex HPLC instrument Method development, implementation and transfer are more difficult Typically longer analysis times since column must be calibrated with initial mobile phase

Degasser
Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang terlarut. Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada pompa atau timbulnys noise pada detektor tertentu (RID, FLD dan Amperometric Detector) Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau ultrasonikasi.

Pompa HPLC
Pompa Pencampur untuk menarik solvent fase gerak dari botol reservoir Pompa Analisis mengalirkan fase gerak ke dalam kolom Sistem Pompa: Tekanan Tinggi Tekanan rendah

Pada : HPLCMengapa perlu tekanan tinggi?

Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um. Faktor C pada hukum van Deemter sebanding dengan dp2 Ukuran partikel makin kecil luas permukaan makin besar transfer massa dari fase gerak ke fase diam atau sebaliknya makin besar kolom semakin efisien dan resolusi peak semakin baik. Penggunaan ukuran partikel kecil diperlukan tekanan tinggi Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000 6000 psi)

Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)

Pompa Analisis
Tekanan: 6000-9000 psi (lbs.m2) Kecepatan alir: 0.1 10 ml/menit Terbuat dari baja atau teflon Dapat memberikan aliran isokratik dan gradien

Pompa tekanan rendah

DIAGRAM SISTEM POMPA KCKT TEKANAN RENDAH

( Low Pressure System

Pump )

2/2/2014

kuliah ka ii-a

33

Sample Injection
Load and Inject -Position

Load Inject Position

Sample Injection
Load and Inject -Position

HPLC Columns
Column: the key part of the separation

HPLC Column Categories

Column Hardware: Standard or Cartridge, stainless, PEEK, titanium Chromatographic Modes: Normal-phase (NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange (IEC), size exclusion (SEC) Dimensions (: Prep, semi-prep, analytical, fast LC, micro, nano Support Types: Silica, polymer, zirconia, hybrid

HPLC Column: Specification

CS-Chromatographie Service Multospher 120 RP-18 HP 5

Sulendimension (Lnge x ID) Art.-Nr. xxxx HPLC-Sule 250x3 mm Multospher 120 RP-18 HP-5 Ch. 70801 Sulen-Nr. 0103-01 Flow -------- Muster-Chromatographie Tel., Fax, mail

Korngre in m

Modifizierung des Kieselgels

Porengre (Angstrm) Herstellername des Kieselgels Flussrichtung

Column packing characteristics

Critical to the column performance Support type: silica, polymer, hybrid Bonded Groups: C18, C8, C4, C3, CN Particle size (dp): 2, 3, 5 m Pore size (dpore): 100-500 m2/g Ligand (Bonded phase) density: 2-4 mole/m2

Polymer support materials

Wide pH range: 1-14 Absence of active silanol groups cross-linked polystirene-divinylbenzene, polyether, polymetracrylates for bioseparation

TESTING KINERJA KOLOM KCKT

1. JUMLAH PELAT TEORI ( N ) Number of Theoretical Plates Idealnya harga N = 10 000 ,informasi disebutkan - panjang dan diameter internal kolom - macam komponen yang dianalisis dan harga k - fasa mobil dan fasa diam kolom - ukuran sampel - temperatur
2/2/2014
kuliah ka ii-a 43

2. FAKTOR SIMETRI

Tailing Factor ( TF ) Symmetry Factor

Foley and Dorsey
b 0.1 TF = a 0.1

harus kurang

dari 2.5 kalau lebih dari 3.0 tidak bisa dilakukan analisis kuantitatif

3. RESOLUSI Harga R = 1 1,5

2/2/2014

kuliah ka ii-a

44

REGENERASI KOLOM
1. KOLOM SILICA GEL ( Normal Phase ) Dilakukan pengaliran solvent berikut dengan kecepatan alir 1 3 ml / menit : -75 ml tetrahydrofuran -75 ml metanol -75 ml asam asetat 1 5 % dalam aquadest -75 ml pyridin 1 5 % dalam aquadest -75 ml tetrahydrofuran -75 ml dichlorometan -75 ml n hexan
2/2/2014
kuliah ka ii-a 45

REGENERASI KOLOM
2. KOLOM FASA SUNGSANG ( Reversed Phase Column ) Dilakukan pengliran solvent berikut dengan kecepatan alir 0,5 2 ml / menit : -75 ml aquadest + 4 x Injeksi 100 ul DMS -75 ml metanol -75 ml chloroform -75 ml metanol - Aquadest 0,1M H2SO4 Aquadest
2/2/2014
kuliah ka ii-a 46

RANGKAIAN KOLOM KCKT

Kolom KCKT panjangnya maksimal 25 cm, efisiensinya kurang terutama untuk analisis multi komponen dengan matrik sampel yang rumit. Untuk itu diatasi dengan perangkaian kolom KCKT secara seri dengan berpedoman pada rumus : R 2 1,25 2 R( ) ( ) 4 Rexp 0,6
2/2/2014
kuliah ka ii-a 4 kali seri Panjangkan kolom 47 !

Particle size (dp)

Particle size and size distribution key factor for efficiency and back pressure of column C term of van Deemter eq. proportional to dp2. Decreasing particle size (the L constant) increase column efficiency and peak resolution

Surface area and Pore size

Chromatographic supports are porous to provide more surface area; to maximize interaction of solutes with bonded stationary phase Packing for small molecules separations have pore size from 60 to 200 A and surface area 100500 m2/g.

Particle Size and Column Performance

(300 psi) (1300 psi) (10,000 psi) (34,000 psi)

Chromatography Stationary Phases

Silica Gel
O O O | | | OSiOSiOSiOH | | | O O O | | | OSiOSiOSiOH | | | O O O

Derivatized Silica Gel

O O O | | | OSiOSiOSiOR | | | O O O | | | OSiOSiOSiOR | | | O O O

Where R = C18H37 hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv. silica or C18)

bulk (SiO2)x

surface

bulk (SiO2)x

surface

relatively polar surface normal phase

relatively nonpolar surface reversed phase

Bonded Phases
C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3

C-8 C-18 CN

Octyl Silyl Octadecyl Silyl Cyanopropyl Silyl

-Si-(CH2)7-CH3 -Si-(CH2)17-CH3 -Si-(CH2)3-CN

C18 Phase designed to retain very polar compounds

CH3 Si-O-Si-(CH2)17-CH3 CH3

Protection of Siloxane Bonds With Bulky Alkyl Groups

Monolithic Silica Rods Increased Flow Rates with Excellent Resolution

HPLC Detectors
To detect the separated analytes

An ideal Detector:
UNIVERSAL (i.e. detects everything) SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of analytes) LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between intensity of response and amount of analyte). give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the analyte is, even if you didnt know beforehand).

Pada umumnya detektor KCKT bersifat Blind and Differential kecuali FTIR dan MS yang berfungsi sebagai penganalisis yang spesifik, sedangkan KCKT bersifat pemisah selektif pada instrumen terpadu hyphenated instrument : ka ii-a 2/2/2014 kuliah 59

DETEKTOR

MACAM DETEKTOR KCKT

2/2/2014

kuliah ka ii-a

60

PERSYARATAN DETEKTOR KCKT

Sensifitas yang tinggi sampai ng, pg atau fg. Memberikan tanggap kulitatif secara universal atau spesifik terhadap analit yang ditentukan. Memberikan tanggap kuantitatif. Volume mati ( Death Volume ) yang kecil. Tidak bersifat destruktif ( kecuali pada LC-MS ). Tidak peka terhadap perubahan temperatur kecuali detektor Fluorescence dan Refractive Index . Mudah didapat, kecuali detektor Radio aktif.
2/2/2014

kuliah ka ii-a

61

HPLC Detectors
UV-Vis Detector Photodiode array Detector (PDA = DAD) Refractive Index Detector (RID) Fluorescence Detector (FLD) Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) Electrochemical Detector (ECD) Conductivity Detector Radiometric Detector

Hyphenated Systems LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR

HPLC Detectors
UV-Vis Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105) Can be used with gradient elution Requires chromophore Refractive Index Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 102) Isocratic only Nearly universal detection Evaporative Light Scattering Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105); Non-linear calibration required Can be used with gradient elution Nearly universal detection

UV-Vis Detector
Paling banyak digunakan Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan flow cell Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang dapat bergerak dan dapat memilih panjang gelombang spesifik yang masuk melalui celah (slit) 190 600nm Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan sensitivitas pada daerah visibel. Macam UV-Vis:
Fixed wave length Variable wave length Multiple variable wave length Photo diode-array

DETEKTOR UV - VIS 1.FIXED WAVELENGTH ( FW ) a = 254 nm dan a = 280 nm 2.VARIABLE WAVELENGTH ( VW ) a = analytical 3. MULTIPLE WAVELENGTH ( MW ) a = analytical, confirmation,reference 4. PHOTO DIODE ARRAY ( PDA ) a = 190 nm 650 nm ( full scale )
2/2/2014

kuliah ka ii-a

65

UV-Vis Detector
Lamp Cut-off filter Holmium oxide filter

Slit Sample diode Mirror 1

Grating

Flow cell

Mirror 2 Reference diode

UV-VIS Diode Array Detector

PDA
Disebut juga diode array detector Untuk mengukur spektrum UV dari peak yang terelusi Mampu melakukan identifikasi peak Sensitivitas detektor lebih rendah pada model terdahulu tetapi pada model terkini memiliki sensitivitas tinggi PDA umumnya menggunakan charge coupled diode-array with 512-1,024 diode (or pixels) mampu resolusi spektro 1 nm.

PDA
Dengan software pengevaluasi spektra dapat menampilkan kromatogram dan spektra sampel Dapat mengenali panjang gelombang maksimum, peak matching (menghitung match factor atau MF), library search dan evaluasi kemurnian peak (peak purity) Dapat menampilkan 3-D spektra dan countor maps.

Overlay spectra

200

250

300

350

400

nm

Peak Purity test: HPLC

Spektra UV/Vis analit dan zat standar (authentic reference material) dengan diode array detector overlay Evaluasi korelasinya (r, MF, FTIR, MS) Pengukuran spektra pada upslope, apex dan down slope Peak harus pure

Match Factor
MF = 1000 r = 1 100% pure peak MF > 990 pure MF < 900 not pure 900 < MF < 950 contaminated

Pure and Impure HPLC peaks

Peak purity tests can also be evaluated with

The 3D-spectra of Photodiode array detectors Mass spectrometry

Comparison by 3 Point Spectrum

Acetyl Salicylic Acid

up slope, peak top down slope

Refractive index
Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel sampel yang mengandung analit yang terelusi dengan sel pembanding. Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug) Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan digunakan umumnya untuk analit yang memiliki gugus kromofor lemah seperti gula, trigliserida, asam-asam organik dll. Detektor standar untuk GPC Tidak dapat digunakan untuk gradien

Refractive Index Detector

Evaporative Light Scattering Detector

Mass Spectrometer (MS)

MS works by ionizing molecules then sorting and identifying the ions according to their mass-to-charge (m/z) ratios. Two key components in this process: 1. ion source generates the ions, 2. mass analyser sorts the ions.

 ESI: Electrospray ionization MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ionization APCI: Atomospheric-pressure chemical ionization

HPLC
Providing best separation, But unable to identify the components unequivocally

MS
Providing Mass spectra of compounds specific for identification Identification much more difficult (or impossible) for a component of mixture

LC-MS
LC-MS/MS
LC-tandem MS = MSn

Mass Spectrometer
HPLC Ionization Source Mass Analyzer Detector

MALDI Electrospray ionization (ESI) Atmospheric pressure chemical ionization (APCI) FAB EI

Single quadrapole (SSQ) Triple quadrapole (TSQ) Quadrapole ion trap Time-of-flight (TOF) Fourier Transform (FTMS) Magnetic sector

Ionization source
Coverts analytes of interest to gas phase ions ESI: Electrospray ionization MALDI: Matrix-assisted laser desorption/ionization APCI: Atomospheric-pressure chemical ionization

ESI

APCI

Common Types of Analysers

Quadropole Ion trap Triple quadrupole Time of Flight Fourier transform MS (FTMS)

LC-MS

CID: Collision Induced Dissociation Q1: single Quaduprole

Triple Quaduprole LC-MS/MS

LC-MS/MS

TIC: Total Ion Chromatogram

Mass Spectra

Equipment

Your HPLC Success

Service Support

Your HPLC success depends on

The suitability of the equipment you buy Your ability to keep it up and running (or find someone else who will service it) The support you receive, starting out in new directions or in solving problems that come up

Systematic Troubleshooting
All of the components of HPLC or LC-MS/MS can have problems require troubleshooting An ounce of prevention is worth a pound of cure The best troubleshooting strategy is to prevent problems from occurring by exercising best practices in daily HPLC operation.

Common HPLC Problems

Problems are caused by component malfunction (Pump, degasser, injector, data system, column) Faulty preparation of mobile phase or sample preparation Problems can be categorized into several areas:
Pressure problems Baseline problems Peak problems Data performance problems

Baseline Problems

Problems and possible causes

Kasus Kebocoran
a. Kondisi normal b. Flow rate menurun peak melebar, tinggi peak naik c. Efek = B, tinggi peak turun

d. Peak I lebih ramping dan pendek

Experience is the best teacher

Points to be considered for maintenance

Pump
check a leak of plunger seal wash a behind plunger seal for buffer

Injector

Column

wash an injection port after every injection select a suitable washing solvent
do not keep a buffer solution check a life time of lamp or electrode

Detector

Performance verification of HPLC

Module Pump Performance attributes Flowrate accuracy Gradient accuracy Pressure test Precision Linearity Carry over General Expectation 2% 1% No leak 1% RSD r > 0.999 < 1% Frequency 6 months 6 months 6 months 6 months 12 months 6 months

Injector

Detector

Wavelength accuracy Linearity of response Noise and drift

2nm r > 0.999 Noise: 10-5 AU Drift: 10-4 AU/h

6 months 12 months 12 months

Column compartment

Temperature accuracy

2%

6 months

Pemeliharaan kolom
Kolom umumnya tahan 3-24 bulan atau 1000-3000 x injeksi tergantung jenis fase gerak dan sampel Simpan kolom RP dalam pelarut CAN atau metanol atau campuran air dan pelarut organik Tutup ujung kolom bila tida dipakai Cuci kolom sebelum dan sesudah digunakan Gunakan guard column (jika bekerja dengan sampelsampel kotor) Untuk kolom silika, jangan bekerja di luar pH yang diperbolehkan (pH 2.5 8). Kolom modern (pH 1.5-10) Jangan bekerja pada temperatur tinggi

Regenarasi kolom
Urutan flushing untuk kolom RP HPLC:
Water Methanol CH2Cl2 Methanol

SYSTEM SUITABILITY TESTS

System suitability is an integral part of many analytical procedures. The tests are based on the concept, that the equipment, electronics, analytical operations and samples to be analyzed constitute an integral system that can be evaluated as such.

[ System Suitability Parameters ] Capacity Factor ( k' ) Precision/Injection Repeatability ( RSD ) Relative Retention () Resolution ( Rs ) Tailing Factor ( T ) Theoretical Plate Number ( N )

SYSTEM SUITABILITY PARAMETERS

Determination and Standards of Parameters

Capacity Factors ( k' ) k' = () / k' Precision/Injection Repeatability ( RSD )

Solvent peak Solvent tail t0 tR1 tW1 tR2 tW

2

Relative Retention ( ) = k' 1 / k' 2

RSD

There is not an essential parameter

Resolution ( Rs ) Rs = (21) / (1/)(12) Rs Tailing Factor ( T ) T = x / T Theoretical Plate Number ( N ) N =(/)2 = / N

as long as the resolution( Rs ) is stated.

Wx

0.05h

SST results are not OK

Check the Mobile Phase (pH, Composition) Flow Rate Change the Column or regenerate it Optimization of the mobile phase

Analisis Kualitatif
Berdasarkan waktu retensi
tR A = tR B zat A mungkin sama dengan B tR A tidak sama dengan tR B zat A tidak sama dengan zat B

Untuk sampel kompleks tR dipengaruhi banyak faktor gunakan waktu retensi relatif (RRT):
tR analit dibandingkan tR komponen pembanding dalam sampel

Penambahan zat standar ke dalam sampel Data spektra dari PDA (match factor) atau MS

QUALITATIVE ANALYSIS
Compare Retention Times Spike Sample with Standard Collect and analyze Use Hyphenated Technique : LC MS Use a Diode Array Detector Use Peak Ratios at Different Wavelengths

2/2/2014

kuliah ka ii-a

104

Quantitative Analysis Normalization method External standard method Internal standard method Standard addition method

ANALISIS KUANTITATIF MULTI KOMPONEN PADA KCKT

1. NORMALISASI AREA 2. NORMALISASI AREA DENGAN FAKTOR RESPON (TANGGAP) DETEKTOR. 3. DENGAN STANDAR EKTERNAL 4. PENAMBAHAN STANDAR INTERNAL.
2/2/2014

kuliah ka ii-a

106

QUANTITATIVE ANALYSIS
Peak Height or Area Chromatogram

Peak height unaffected by flow variations. Peak area should be used for badly tailing peaks. Both are imprecise withka irreproducible injection kuliah ii-a 107 volume 2/2/2014

Quantitation by Normalization Method

All the analytes present in the sample must elutes from the column, with enough resolution and, furthermore have to be detected by the available detector.
The peak area is proportional to the weight of the analytes having passed through detector cell The analytical signals lies within the linearity ranges
Thus,
Percentage in weight of each analyte

mi = KiAi so % i = Ai / Ai X 100

Quantitation by External Standard

This method is the most general method for determining the concentration of an analyte in samples It involves the construction of a calibration plot (Area or height vs. Analyte concentrations) by using some concentrations (minimum 3-4 concentrations) of external standard; the concentration of the analyte can be determined by interpolation. It is not recommended to do extrapolation. Do not forget to test whether the HPLC system is still OK by using system suitable test

External Standard Calibration

Calculation of Results
Y = aX + b
125 ppm a : SLOP b : Y intercept 2500

[Concentration]

2500 [Peak Area]

2. STANDAR EKSTERNAL Prinsip : Memakai standar yang sama dengan analit 3. STANDAR INTERNAL Prinsip : Semua konsentrasi standar dan sample ditambah standar internal sejumlah yang sama. Perhitungan dengan cara kurva baku

Aa A IS

2/2/2014

kuliah ka ii-a Cppm

111

ANALISIS KUANTITATIF SINGLE KOMPONEN DENGAN KCKT

1. STANDAR ADISI Tidak memungkinkan untuk pemakaian standar internal Hasil analisis dipengaruhi matrik sampel Kadar analit dalam sampel < LOQ (Limit of Quantitation). Prinsip : Sejumlah analit dengan kadar yang diketahui dan bervariasi meningkat ditambahkan pada sampel (volume sampel sama)

Csamp.

Asamp Astd

xCstd

Kelemahan : Volume terinjeksi harus tepat Pengenceran dan penimbangan harus saksama kuliah ka ii-a 112 2/2/2014

Disadvantage of external standard calibration method

Injection error will directly influence the quantitative result. 10 uL injection 11 uL injection

100 ppm

110 ppm

Advantage of internal standard calibration method

Injection error can be eliminated.

10 uL injection
1000 IS 2000 T

11 uL injection
1100 IS 2200 T

2000 / 1000 = 2

2200 / 1100 = 2

Disadvantage of internal standard calibration method

Separation is slightly difficult.
IS T T

IS

IS

Disadvantage of internal standard calibration method

It is difficult to find the IS compound.
The chemical structure of IS compound is similar with one of target compound. IS sample is not existent in the actual sample.

Calibration Method
External standard calibration
Separation is not difficult Injection error will directly influence the quantitative result

Internal standard calibration

Injection error can be eliminated Recovery in the pretreatment procedure can be estimated Separation is slightly difficult Difficult to look for the IS compound

Cara Berlaboratorium yang Baik

Good Laboratory Practices ISO 17025 diadopsi di Indonesia menjadi SNI 19-17025 Laboratorium harus memiliki sistem mutu, yakni:
Kebijakan mutu Panduan mutu (SOP = standard operating procedure) Instruksi Kerja Form

Catat apa yang dilakukan dan lakukan apa yang tercatat

ISO 17025
Kualifikasi personil Validasi metode Kualifikasi instrumen (kalibrasi alat)

29042013

GAS KROMATOGRAFI

121