ANALISIS SEDIAAN LIKUIDA

DENGAN KCKT

Pramudita Riwanti, M.farm.,apt

 SEDIAAN FARMASI BENTUK CAIRAN

MENURUT BPFI V (2014)

1. EMULSI : SISTEM DUA FASE, YG SALAH SATU

CAIRANNYA TERDISPERSI DALAM CAIRAN YG LAIN
DALAM BENTUK TETESAN KECIL
2. LARUTAN (SOLUTION) : SEDIAAN CAIR YG
MENGANDUNG SATU ATAU LEBIH ZAT KIMIA YG
TERLARUT
3. SUSPENSI : SEDIAAN CAIR YG MENGANDUNG
PARTIKEL PADAT TDK LARUT YG TERDISPERSI
DALAM FASE CAIR
 PREPARASI SAMPEL

• Larutan 🡺 Siap disuntikkan, diencerkan atau ditambah

dapar/standar internal lebih dahulu
• Padat 🡺 Perlu dilarutkan terlebih dahulu
Saring (0.2 – 0.45 μm) sebelum disuntikkan
⮚Solid Handling 🡺 grinding, milling, homogenization
⮚Extraction 🡺 Shaking, ultrasonication, Soxhlet, Liquid-liquid Extraction,
Solid Phase Extraction (SPE)
⮚Liquid Handling 🡺 Pipetting, dilution, concentration, pH/ionic strength
adjustment
⮚Phase separation 🡺 filtration, centrifugation, precipitation
⮚Sample clean-up: Column chromatography, SPE
⮚Derivatization: pre or post column derivatization
 HPLC
High Performance Liquid Chromatography
High Pressure Liquid Chromatography
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Atau dapat disingkat LC

Chromatography 🡺 teknik pemisahan

Liquid 🡺 Fase gerak berupa cairan

High Pressure 🡺 digunakan tekanan tinggi

untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom
 KEUNGGULAN DAN KELEMAHAN HPLC

Keunggulan Kelemahan
• Dilakukan pada suhu kamar • Sulit ditemukan detektor yang universal
• Analisis kuantitatif yang cepat • Efisiensi pemisahan lebih rendah
daripada GC
dengan presisi dan akurasi • Lebih rumit dalam pelaksanaannya
yang tinggi • Lebih mahal
• Dapat dioperasikan secara
otomatis
• Sensitivitas detektor yang
tinggi
• Dapat diaplikasikan untuk
berbagai analit dalam jenis
sampel yang lebih luas
 FASE NORMAL DAN FASE TERBALIK

▪ Normal Phase (Fase normal)

▪ Fase diam polar dan fase gerak non polar
▪ Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana dll.

• Reversed Phase (Fase terbalik)

• Fase diam non polar dan fase gerak polar
• Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril
dll.
 KROMATOGRAFI FASE NORMAL

• Disebut juga kromatografi cair-

padat atau kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)
• Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit pada fase
diam polar (silika atau alumina)
• Analit polar lebih tertahan
daripada analit non polar karena
gugus silanol pada silika.
 KROMATOGRAFI FASE TERBALIK

• Pemisahan didasarkan atas koefisien

partisi analit dalam fase diam dan
fase gerak
• Urutan elusi: analit polar terelusi
lebih dahulu, analit non plar terelusi
terakhir
• Cocok untuk analisis zat-zat yang
larut dalam air, semipolar atau
beberapa senyawa non polar.
 FASE GERAK

• Fase gerak diletakkan

dalam botol-botol
reservoir.
 FASE GERAK

• Zat cair yang

digunakan sebagai
fase gerak harus
saling campur.
 HPLC MOBILE PHASE

• High solubility for the sample components

• Non corrosive to HPLC system components
• High purity, low cost, UV transparency
• Others: low viscosity, low toxicity, non
flammability
 REVERSED-PHASE MOBILE PHASES

• Water
• Methanol
• Acetonitrile
• THF
• Additives, salts, acids, bases
• Ion pairing
 KEMURNIAN FASE GERAK

• Diperlukan solvent dengan Solvent UV Cutoff (nm)

kemurnian tinggi Acetonitrile 190

Water 190
• Adanya pengotor
Cyclohexane 195
(impurities) pada solvent Hexane 200
dapat menimbulkan Methanol 210
gangguan analisis. Ethanol 210
Diethyl Ether 220
• Gunakan HPLC grade Dichloromethane 220
• Air sebagai fase gerak: Chloroform 240
Carbon Tetrachloride 265
digunakan water for
Tetrahydrofuran 280 (220)
injection
Toluene 285
Pengaruh
pencampuran
fase gerak
Pencampuran
pelarut (terutama
metanol dan air) 🡪
terjadi kontraksi
volume 🡪 Waktu
retensi berubah
 PELARUT UNTUK SAMPEL

• Pelarut sebaiknya sama dengan fase gerak

• Jika tidak 🡪 dapat terjadi pengendapan di kolom,
pelebaran peak, tailing atau terbentuknya peak
baru.
 Isocratic and Gradient Elution

Isocratic elution:
Constant mobile phase composition during run

Gradient elution:
Programme a changing (stepwise or continuous) mobile
phase composition during the run 🡺 For more complex
mixtures
 GRADIENT ANALYSIS
Advantages:
• Better suited for complex samples
• Better resolution of early and late eluting peaks
• Better sensitivity of late eluting peaks
• Higher peak capacity (fit more peaks in the chromatogram)

Disadvantages
• More complex HPLC instrument
• Method development, implementation and transfer are more
difficult
• Typically longer analysis times since column must be calibrated
with initial mobile phase
 DEGASSER

• Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang

terlarut.
• Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada
pompa atau timbulnys noise pada detektor tertentu (RID,
FLD dan Amperometric Detector)
• Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau
ultrasonikasi.
 POMPA HPLC

• Pompa Pencampur 🡺 untuk menarik solvent fase gerak dari

botol reservoir
• Pompa Analisis 🡺 mengalirkan fase gerak ke dalam kolom

• Sistem Pompa:
• Tekanan Tinggi
• Tekanan rendah
 PADA : HPLC MENGAPA PERLU TEKANAN
TINGGI?

• Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing kolom (silika)

yang sangat kecil, umumnya 3-10um.
• Faktor C pada hukum van Deemter sebanding dengan dp2
• Ukuran partikel makin kecil 🡺 luas permukaan makin besar 🡺
transfer massa dari fase gerak ke fase diam atau sebaliknya
makin besar 🡺 kolom semakin efisien dan resolusi peak
semakin baik.
• Penggunaan ukuran partikel kecil 🡺 diperlukan tekanan tinggi
• Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang kolom 10-
30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000 – 6000 psi)
Particle Size and Column Performance

(300 psi)
(1300 psi)
(10,000 psi)
(34,000 psi)
 PEMELIHARAAN KOLOM

• Kolom umumnya tahan 3-24 bulan atau 1000-3000 x

injeksi tergantung jenis fase gerak dan sampel
• Tutup ujung kolom bila tidak dipakai
• Cuci kolom sebelum dan sesudah digunakan
• Gunakan guard column (jika bekerja dengan sampel-
sampel kotor)
• Untuk kolom silika, jangan bekerja di luar pH yang
diperbolehkan
• Hindari bekerja pada temperatur tinggi
 HPLC Detectors
• To detect the separated analytes

An ideal Detector:
• UNIVERSAL (i.e. detects everything)
• SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of analytes)
• LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between
intensity of response and amount of analyte).
• give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the
analyte is, even if you didn’t know beforehand).
 HPLC DETECTORS

• UV-Vis Detector
• Photodiode array Detector (PDA = DAD)
• Refractive Index Detector (RID)
• Fluorescence Detector (FLD)
• Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)
• Electrochemical Detector (ECD)
• Conductivity Detector
• Radiometric Detector
 UV-VIS DETECTOR

• Paling banyak digunakan

• Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan flow cell
• Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang dapat
bergerak dan dapat memilih panjang gelombang spesifik yang
masuk melalui celah (slit)
• 190 – 600nm
• Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan sensitivitas pada
daerah visibel.
• Macam UV-Vis:
• Fixed wave length
• Variable wave length
• Multiple variable wave length
• Photo diode-array
 PDA

• Disebut juga diode array detector

• Untuk mengukur spektrum UV dari peak yang terelusi
• Mampu melakukan identifikasi peak
• Sensitivitas detektor lebih rendah pada model terdahulu tetapi
pada model terkini memiliki sensitivitas tinggi
• PDA umumnya menggunakan charge coupled diode-array with
512-1,024 diode (or pixels) 🡺 mampu resolusi spektro 1 nm.
 PDA

• Dengan software pengevaluasi spektra 🡺 dapat menampilkan

kromatogram dan spektra sampel
• Dapat mengenali panjang gelombang maksimum, peak matching
(menghitung match factor atau MF), library search dan evaluasi
kemurnian peak (peak purity)
• Dapat menampilkan 3-D spektra dan countor maps.
OVERLAY SPECTRA
 PEAK PURITY TEST: HPLC

• Spektra UV/Vis analit dan zat standar (authentic

reference material) dengan diode array detector 🡺
overlay 🡺
Evaluasi korelasinya (r, MF, FTIR, MS)
 MATCH FACTOR

• MF = 1000 🡺 r = 1 🡺100% pure peak

• MF > 990 🡺 pure
• MF < 900 🡺 not pure
• 900 < MF < 950 🡺 contaminated
 Pure and Impure HPLC
peaks

• Peak purity tests can also be evaluated with

– The 3D-spectra of Photodiode array detectors
– Mass spectrometry
 ANALISIS KUALITATIF HPLC

• Berdasarkan waktu retensi

• tR A = tR B 🡺 zat A mungkin sama dengan B
• tR A tidak sama dengan tR B 🡺 zat A tidak sama dengan zat B
• Untuk sampel kompleks tR dipengaruhi banyak faktor 🡺
gunakan waktu retensi relatif (RRT):
• tR analit dibandingkan tR komponen pembanding dalam
sampel
• Penambahan zat standar ke dalam sampel
• Data spektra dari PDA (match factor) atau MS
 QUANTITATIVE ANALYSIS

• Normalization method
• External standard method
• Internal standard method
• Standard addition method
 QUANTITATION BY NORMALIZATION
METHOD

All the analytes present in the sample must elutes from the column, with
enough resolution and, furthermore have to be detected by the available
detector.

The peak area is proportional to the weight of the analytes having passed
through detector cell

The analytical signals lies within the linearity ranges

Thus,
Percentage in weight of each analyte mi = KiAi
so % i = Ai / ∑ Ai X 100
 QUANTITATION BY EXTERNAL STANDARD

This method is the most general method for determining the concentration
of an analyte in samples
It involves the construction of a calibration plot (Area or height vs.
Analyte concentrations) by using some concentrations (minimum 3-4
concentrations) of external standard; the concentration of the analyte
can be determined by “interpolation”. It is not recommended to do
“extrapolation”.
Do not forget to test whether the HPLC system is still “OK” by using
“system suitable test”
 EXTERNAL STANDARD CALIBRATION
CALCULATION OF RESULTS

Y = aX + b
[Concentration

a : SLOP
125 ppm b : Y intercept

2500
2500
]

[Peak Area]
 DISADVANTAGE OF EXTERNAL STANDARD
CALIBRATION METHOD

• Injection error will directly influence the quantitative result.

10 uL injection 11 uL injection

100 110 ppm

ppm
 ADVANTAGE OF INTERNAL STANDARD
CALIBRATION METHOD

• Injection error can be eliminated.

10 uL injection 11 uL injection
2200
2000 1100
1000
T
T IS
IS

2000 / 1000 = 2 2200 / 1100 = 2

 DISADVANTAGE OF INTERNAL STANDARD
CALIBRATION METHOD

• Separation is slightly difficult.

I
T I T
S
S

T
I
S
 DISADVANTAGE OF INTERNAL STANDARD
CALIBRATION METHOD

• It is difficult to find the IS compound.

• The chemical structure of IS compound is similar
with one of target compound.
• IS sample is not existent in the actual sample.
 CALIBRATION METHOD

• External standard calibration

• Separation is not difficult
• Injection error will directly influence the quantitative
result
• Internal standard calibration
• Injection error can be eliminated
• Recovery in the pretreatment procedure can be
estimated
• Separation is slightly difficult
• Difficult to look for the IS compound