HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAFI (HPLC)
OLEH : ALIKA FUADAH YASMIN
XIII KA1
 Pengertian dan Fungsi HPLC
HPLC merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair
yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afiniitas terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan
dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa
diam.
Fungsi HPLC adalah untuk menentukan atau mengukur atau
menganalisa kadar bahan aktif pada suatu sampel (obat, makanan
atau herbal).
 Prinsip kerja HPLC
Pada dasarnya, prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi
lapis tipis dan kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang
digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga
luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi
lebih baik dan efisien.
Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat
bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya.
Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada
fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan
mengahasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.
ada 3 sistem HPLC, yaitu:
1. Sisitem elusi isokratik (isocratic elution)
Sampel diinjeksikan kedalam kolom yang komposisi fase geraknya
tidak berubah selama analisis. Analisis dilakukan sampai sampel terelusi
(terurai) dari kolom.
2. Sistem elusi gradient (Gradien elution)
Ada perubahan fasa gerak baik secara bertahap atau berkesinambungan
selama proses berlangsung. Pada mula-mula elusi, seluruh komponen
sampel ditahan dibagian atas kolom, setelah gradient mulai, kekuatan
elusi fasa gerak akan meningkat.
3. Sistem elusi bertahap
Baik digunakan untuk sampel yang mengandung komponen yang
bergerak cepat.
 Teknik pemisahan dalam HPLC berdasarkan
fasa diam dan fasa geraknya
1. Kromatografi partisi
Komponen sampel (linarut) dibagi antara fasa gerak cair dengan
cairan yang tidak bercampur yang dilapiskan pada suatu partikel
padat sebagai fasa diam. Fasa diam dapat berupa cairan yang
disalutkan pada partikel penyangga. Komponen sampel yang
terikat lebih banyak di fasa diam akan tertahan lama dalam kolom.
2. Kromatografi adsorpsi
Fasa diam menggunakan partikel silica atau alumina hidrat. Fasa
gerak dan komponen sampel (linarut) berkompetisi terhadap lokasi
aktif adsorpsi pada partikel fasa diam.
3. Kromatografi pertukaran ion
Teknik ini digunakan untuk sampel yang bersifat
ionic/terionkan. Fase diamnya mempunyia permukaan berlawanan
dengan muatan dari sampel. Fase geraknya berupa larutan elektrolit
dalam air yag mendukung ionisasi sampel.
4. Kromatografi eklusi ukuran (kromatografi gel)
Teknik ini digunakan untuk solute dengan molekul relative (Mr)
>1000 yang bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi
gel.
 Dua jenis fase dalam HPLC
Dua jenis fase ini tergantung pada polaritas relative dari pelarut dan
fase diam.
1. Fase normal
Digunakan fase gerak yang bersifat non polar dan fase diamnya
bersifat polar (lebih polar).
2. Fase balik/terbalik
Digunakan fase gerak bersifat polar/lebih polar dan fase
diamnya bersifat non polar.
Bagian-bagian HPLC
1. Penampung fasa gerak (reservoir)
Biasanya terbuat dari gelas atau baja nikarat dengan volume
500 ml atau lebih yang dilegkapi dengan alat pembuang gas
terlarut. Sistem pembuanagan gas bisa menggunakan teknik
vakum, distilasi, pemanasan dan pengadukan, atau pembuanagan
gas terlarut dengan menggunakan aliran gas lain yang memiliki
kelarutan sangat rendah.
2. Sistem pemompaan.
Pompa berfungsi untuk mendorong fasa gerak dan sampel
masuk kedalam kolom. Tekanan pompa yang diperlukan untuk
memompa fasa gerak harus cukup tinggi karena ukuran fasa diam
didalam kolom sangat kecil.
Syarat pompa yang digunakan:
1. Dapat memompa fasa gerak secara konstan.
2. Dapat memberikan tekanan yang cukup tinggi.
3. Memberikan fluktuasi tekanan seminimal mungkin
4. Memberikan noise yang rendah
5. Cara kerja sederhana
6. Cukup inert terhadap pelarut-pelarut yang digunakan
 Sistem pemompaan solven pada HPLC memerlukan syarat-
syarat sebagai berikut :
1. Tekanan harus bisa mencapai 6000-8000 psi,
2. Keluaran harus bebas pulsa,
3. Kecepatan alir antara 0,1 – 10 ml per menit,
4. Pengulangan pengaturan kecepatan aliran tidak berbeda lebih
dari 0,5%,
5. Terbuat dari bahan tahan korosi,
6. Dapat memberikan aliran sistem isokratik maupun gradient.
3. Sistem injeksi sampel
Sistem injeksi yang digunakan adalah sistem injeksi katup (loop
volve).
Katup ini tidak memutuskan aliran selama proses penyuntikan
dan meningkatkan kecermatan. Katup ini memberikan volume
suntik yang tepat walaupun ada tekanan balik dan tidak
memerlukan lagi pipet mikro. Volume suntik biasanya 10-50µL
dengan keterulangan 0,1%.
4. Kolom
Pemilihan kolom dan pelarut untuk HPLC
Kolom yang baik harus memberikan resolusi yang baik
dengan waktu pemisahan yang tidak lama (<20 menit)
Kolom HPLC umumnya dibuat dari pipa baja nikarat
dengan panjang kolom yang paling banyak digunakan
adalah 25 cm, diameter 4,6 mm, dengan ukuran partikel 5
µm. Kolom ini memiliki 40.000 – 60.000 plat per meter.
Kolom dapat dipanaskan sampai suhu 60°C agar dihasilkan
pemisahan yang lebih efisien atau kolom dipertahankan
pada suhu kamar.
5. Detektor
Detektor adalah suatu instrument yang dihubungkan
pada akhir kolom yang berfungsi untuk memberikan
respon komponen-komponen yang telah dipisahkan
dalam kolom secara kualitatif dan kuantitatif.
Syarat detector adalah:
1. Sensitif
2. Selektif
3. Stabil dan reprodusibel
4. Linier terhadap konsentrasi pelarut
5. Mudah pengoprasian dan pemeliharaan
6. Sesuai dengan pelarut (eluen) yang digunakan.
Jenis-jenis detector berdasarkan jenis respons:
1. Detektor universal, yaitu detector yang dapat
mendeteksi senyawa secara umum, tidak spesifik
dan selektif. Contoh: detector indeks refraksi dan
konduktometer.
2. Detektor selektif, yaitu detector yang dapat
mendeteksi komponen senyawa tertentu dengan
spesifik dan selektif. Contoh: detector UV/vis dan
fluoresensi.
3. Detejtor identifikasi, yitu detector yang dapat
mengidentifikasikan komponen senyawa. Contoh:
detector diode array dan Mars Spec (MS).
Hasil dari HPLC ini bergantung pada beberapa
hal, antara lain:
1. Temperatur
2. Tekanan
3. Diameter partikel fasa diam
4. Viskositas
5. Panjang kolom
 THANK YOU ^^
YOU CAN FIND ME :
ALIKA FUADAH YASMIN

KAWAII_LIKCHAN

KAWAII.LIKCHAN1611@GMAIL.COM