LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS SEDIAAN FARMASI

Validasi Metode Penetapan Kadar Sulfametoksazol dan Trimetropim

dalam Tablet Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Asisten

: Henry K. S., M.Si., Apt.

Golongan : R
Hari

: Rabu, 08.00-12.00
Kelompok : E
1.
2.
3.
4.

Theresia C.F.A
Sanky Indrajaya
Ivana R. Latuasan
Eunike P.W

2443013123
2443013136
2443013138
2443013144

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS KATOLIK WIDYA MANDALA SURABAYA
2015
I. Tujuan Praktikum

Mahasiswa dapat menentukan validasi metode penetapan kadar zat dalam suatu
sediaan secara kromatografi cair kinerja tinggi.

II.

Dasar Teori
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen campuran tersebut diantarany dua fase, yaitu fase diam
(stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair,
sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam kromatografi fase
bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair
(Acun, dkk, 2010).
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan
setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung
berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif
bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu
sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat
tersebut dalam sample (Riyadi, 2009).
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak
analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada
prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan
satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik
kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010).

Menurut Adnan (1997), komponen utama HPLC adalah :

1. Reservoir pelarut : zat pelarut yang dipakai polaritasnya dapat bervariasi tergantung dari
senyawa yang dianalisis, yang perlu diperhatikan adalah bahwa tempat pelrut tersebut
harus memungkinkan untuk proses menghilangkan gas atau udara yang ada dalam pelarut
2. Pompa : digunakan untuk mengalirkan pelarut sebagai fase mobile dengan kecepatan dan
tekanan yang tetap
3. Injektor : saat sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar pelarut tidak
mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Injeksi dapat menggunakan
syringe.
4. Kolom krmatografi : kolom yang dipakai memiliki panjang 10 25 cm dan diameter 4,5
5 mm yang diisi dengan fase stasioner beukuran 5-10 mikrometer dan terbuat dari
logam atau stainlessteel.
5. Detektor : digunakan untuk mendeteksi sampel. Detektor dibutuhkan untuk mempunyai
sinsitivitas yang tinggi, linear untuk jangka konsentrasi tertentu dan dapat mendekati
eluen tanpa mempengaruhi resolusi kromatografi.
Saat ini, HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara
luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri
makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis
senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionic,
maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hamper sama; pemisahan senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace
elements), dalam jumlah yang banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC
merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis
kualitatif maupun kuantitatif (Cupritabu, 2010).

Menurut Khopkar (1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat dipisahkan dengan
HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi
adsorbsi dan banyak digunakan dalam industi farmasi dan pestisida.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif pada
obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam sediaan
farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika
HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah
sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Cupritabu, 2010).
Sistem Peralatan HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung

fasegerak

antara

sampai

liter

pelarut.

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-

komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk
fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring
terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam
fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen
lain

terutama

di

pompa

dan

detektor

sehingga

akan

mengacaukan.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi)
yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien
digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel
mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau
campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang
paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut
yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan
yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu :
pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat Penyuntikan Sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel
(sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel

Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
prosen pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama

dibanding dengan kolom konvensional, yakni :

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat

(10 -100 l/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika

digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti

klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18)

merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,

sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk
solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan.
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi. Idealnya, suatu detektor harus
mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut : (Khopkar,1990).
Detektor
Absorbansi Uvvis
Fotometer filter

Sensitifita
s (g/ml)

Kisaran
linier

Karakteristik

5 x 10-10
5 x 10-10

104
105

Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif

terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak

Spektrofotomete
r
spektrometer
photo-diode
array
Fluoresensi
Indeks bias
Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri

III.

> 2 x 10-10

105

jenuh.

10-12

104

5 x 10-7

104

Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap

perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat
digunakan pada elusi bergradien

10-8
10-12

104
105

Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase

gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien.
Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya
kontaminasi elektroda.

Alat dan Bahan

Alat : Alat-alat gelas, Timbangan analitik, Ultrasonic, Membrane filter 0,45m,
HPLC & kolom RP18 & detektor UV, Spektrofotometer UV
Bahan : Sulfametaksol, Trimetropim, Metanol for HPLC, Metanol pa, WFI

IV.

Sifat Bahan
1. Sulfametoksazol ( FI V hal 1234)

Pemerian : Serbuk hablur, putih sampai hampir putih, praktis tidak berbau

Kelarutan : praktis tidak larut dalam air, dalam eter dan dalam kloroform, mudah
larut dalam aseton dan dalam larutan natrium hidroksida encer, agak sukar larut
dalam etanol.
2. Trimetropim ( FI V hal 1290)

Pemerian : Hablur atau serbuk hablur, putih sampai krim, tidak berbau
Kelarutan : larut dalam benzyl alcohol, agak sukar larut dalam kloroform dan
dalam methanol, sangat sukar larut dalam air, dalam etanol dan dalam aseton,
praktis tidak larut dalam eter dan dalam karbon tetraklorida.

V.

Cara Kerja
Kondisi analisis HPLC

Detektor
Panjang gelombang

Flow rate
Fase gerak

Pelarut

: UV-VIS
: Sulfametoksazol
: 257 nm
Trimetropim
: 247 nm
: 1,5 ml/menit
: Metanol : Air (60:40)
Metanol : Air (40:60)
: Metanol for HPLC

SELEKTIVITAS
o Pembuatan fase gerak :
Fase gerak 1 :
Metanol:Air (60:40) 500 ml
1. Mengukur metanol p.a 300 ml khusus HPLC + WFI 200 ml

2. Saring menggunakan membran filter

3. Degassing selama 30 menit, untuk menghilangkan udara/gelembung
Fase gerak 2 :
Metanol:Air (40:60) 500 ml
1. Mengukur methanol p.a 200 ml + WFI 300 ml
2. Saring menggunakan membran filter
3. Degassing selama 30 menit, untuk menghilangkan udara/gelembung
Pembuatan larutan baku Trimetropim
Timbang trimetropim 15 mg
Tambahkan methanol p.a ad 25ml (600ppm)
Pipet 266 l dari labu takar
Tambahkan fase gerak ad 5ml (32ppm)
Saring dengan membrane filter 0,45m
Digest inject 20 l
Pembuatan larutan standar Sulfametoksazol
Timbang Sulfametoksazol 15 mg
Tambahkan methanol p.a ad 25 ml (600ppm)
Pipet 1335l dari labu takar
Tambahkan fase gerak ad 5 ml (160 ppm)
Saring dengan membrane filter 0,45m
Digestinject 20 l
Pembuatan larutan campuran sulfametoksazol & trimetropim
Timbang 15 mg Trimetropim dan 15 mg Sulfametoksazol
Tambahkan methanol p.a ad 25 ml dalam labu takar

Pipet 266 l dan 1335 l dari labu masukkan ke labu takar 5 ml

Tambahkan fase gerak ad 5 ml
Saring dengan membrane filter 0,45 l
Digest Inject 20 l
Pembuatan Matriks
Misalnya berat tablet 700mg
R/ Trimetropim
80mg
Sulfametoksazol
400mg
Amilum 2%
14mg
Mg Stearat 4%
17mg
Talk 4%
28mg
Laktosa monohidrat 171mg
LINIEARITAS
Konsentrasi 50-150%
Timbang 75 mg Sulfametokzasol dan 15 mg Trimetropim ad 25 ml methanol pa
600 ppm metanol

50%
ppm
130l

75%

100%

125%

150%

ppm ppm

ppm

ppm

195l 260l

325l

390l

Tambahkan 5 ml fase gerak

Saring digest inject
AKURASI dan PRESISI
Timbang 75 mg sulfametoksazol, 15 mg trimetropim, 41,25mg matriks (3x)

Larutkan dengan 25 ml methanol pa

Pipet 260l ad 5 ml methanol fase gerak

Saring digest inject

 Sampel
Timbang bobot rata-rata tablet

Timbang 131,25 mg ad 25 ml methanol pa (3x)

Pipet 260 l ad 5ml fase gerak

Saring digest inject

VI.

Hasil pengamatan
Sulfametoksazol ( methanol : air = 60:40 )

Trimetropim ( methanol : air = 60:40 )

Campuran sulfa-trimet (metanol : air = 60:40 )

Campuran sulfa-trimet (met:air = 40:60)

PERHITUNGAN
1. Linearitas
Penimbangan Sulfametoksazol 75,55 mg ad 25 ml metanol PA (3000 ppm)
Trimetropim 15,27 mg ad 25 ml metanol PA (600 ppm)
C

Pipet ()

C1

130

C3

260

C5

390

ad

5 ml

C
SULFA
(ppm)

Luas Area
SULFA

C
TRIME
(ppm)

Luas Area
TRIME

16

38492765

80

280892

32

51870785

160

272466

48

78597992

240

216172

SULFAMETOKSAZOL : a = 16215287
b = 1253288,344
r = 0.982
Persamaan y = 16215287 + 1253288,344 x

Kurva Linearitas Sulfametoksazol

100000000
80000000
60000000
Luas Area

40000000
20000000
0
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Konsentrasi

TRIMETROPIM : a = 321230
b = -404,5
r = -0,9196
persamaan y = 321230 - 404,5x

Kurva Linearitas Trimetropim

300000
250000
200000
Luas Area

150000
100000
50000
0
50

100

150

Konsentrasi

2. Akurasi dan Presisi

200

250

AP

Campuran
PCT +
Kafein +
Matriks (g)

0,13232

0,13284

0,13285

ad
(ml)

Konsentrasi
Campuran
(ppm)

Pipet
(ml)

ad
(ml)

Konsentrasi
campuran
(ppm)

5292,8
25

275,226
0,26

5313,6

5314

AP

Konsentras
i campuran
(ppm)

Luas Area
SULFA

275,226

2
3

276,307
276,328

^x

^x

SULFA

Luas Area
TRIME

TRIME

58209898

33,51

229754

226,15

276,307

92688787

61,01

393175

-177,86

276,328

101882615

68,35

401514

-198,48

AP 1

AP 2

AP 3

%recovery S=

33,51
100 =12,18
275,226

%recovery T =

226,15
100 =82,19
275,226

%recovery S=

61,01
100 =22,08
276,307

%recovery T =

177,86
100 =64,37
276,307

%recovery S=

68,35
100 =24,74
276,328

%recovery T =

198,48
100 =71,83
276,328

3. Sampel

Sampel
(g)

Ratarataberat tablet=0.630 g=630 mg

C

ad

sampel

0,1353

25

5412

0,1355

ml

5420

pipet

0.26 ml

S1

d
5

Sampel

Sulfametoksazol

Sulfametoksazol=

^x S

L.area T

^x T

281,424

93358526

61,55

495965

-431,98

281,84

93977116

62,05

446606

-309,95

61,55
630 mg=137,79 mg
281,424

431,98
630 mg=967,04 mg
281,424

Sulfametoksazol=
Trimetropim=

L.area S

m
l

Trimetropim=

S2

62,05
630 mg=138,7 mg
281,84

309,95
630 mg=692mg
281,84

137,79+ 138,7
=138,25 mg
2

%recovery S=

138,25
100 =34,56
400

Trimetropim=

967,04 +692
=829,52 mg
2

%recovery T =

829,52
100 =2073,8
40

1 tablet SULFAMETOKSAZOL 400 mg, TRIMETROPIM 80 mg

VII.

Pembahasan

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah pemisahan

senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase mobile (gerak) dan fase
stasioner (diam). HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa
aktif pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi dalam
sediaan farmasi. Contohnya adalah menetapkan kadar sulfametoksazol dan trimetropim.
Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom
menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan
sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak maksimum pada grafik dari senyawa yang
dipraktikumkan.
Cara kerja HPLC adalah sampel yang larut dalam fase gerak diinjeksikan ke dalam
kolom kromatografi dengan menggunakan syringe. Volume yang ditampung adalah 20l,
jika berlebihan akan dikeluarkan. Fase gerak akan dialirkan dengan menggunakan pompa.
Sampel yang masuk ke dalam kolom akan didorong oleh fase gerak sehingga zat-zat yang
terkandung dalam sampel akan dianalisis dan bereaksi dengan fase diam. Oleh karena
detektor akan dibaca dan dihasilkan keluar berupa grafik dan data tinggi serta luas puncak
dalam bentuk angka.
Pada praktikum ini, kelompok kami melakukan penetapan kadar untuk sulfametoksazol
dan trimetropim dan fase gerak yang kami gunakan adalah methanol : air dengan
perbandingan 60 : 40

VIII.

Daftar Pustaka

Acun., Sodiyc. 2010. Kromatografi Gas.

Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit Andi Offset.
Yogyakarta.
Cupritabu, 2010. Menghitung Kadar Parasetamol dalam Obat dengan HPLC.

Khopkar, S.M., 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.
Riyadi, W. 2009. Identifikasi signal kromatogram HPLC.