HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

A. Pengertian
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering
digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino,
asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-
senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi
dalam sediaan farmasi.

B. Komponen

Diagram di atas menunjukkan komponen utama yang terdapat pada HPLC. Larutan
sampel diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh fase gerak (1) melewati fase
diam pada kolom (5), kemudian hasilnya dibaca oleh detektor (6) dan ditampilkan pada
pengolah data (7) sebagai kromatogram.
Berbeda dengan kromatografi kolom tradisional yang memanfaatkan gravitasi agar
fase gerak dapat melalui fase diam, HPLC menggunakan pompa bertekanan tinggi (2)
untuk mengalirkan fase gerak menuju kolom fase diam.
C. Sistem Peralatan
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem
kromatografi cair seperti ini :

1) Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-
partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan
detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara
 isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien
(komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman
suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas
yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

2) Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3
mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa
atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran
fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan
konstan.

3) Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.
4) Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:

 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan
alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal
sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol
(Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-
reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau
C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
 memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun
tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti
silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang
digunakan.

5) Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa;
dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

 Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

 Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil.
 Stabil dalam pengopersiannya.
 Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
 Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

6) Pengolah Data
Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang terbaca oleh
detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram menggambarkan jumlah
komponen pada sampel dilihat dari jumlah puncak (peak) yang dihasilkan.
Konsentrasi komponen yang hendak dianalisis dapat dihitung dengan
membandingkan luas area peak komponen dengan luas area peak serta konsentrasi
standar.
D. Mekanisme
Sesuai namanya, prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur
sampel. Dalam kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi saat
sampel bergerak melewati fase diam (dapat berupa zat padat atau cair) karena terbawa oleh
fase gerak (dapat berupa zat cair atau gas).

Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan perbedaan afinitasnya

terhadap fase diam. Komponen yang dapat berinteraksi secara kuat dengan fase diam akan
bergerak lebih lambat sehingga dapat terpisah dari komponen lain dengan interaksi yang
lemah.
Ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel
tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit )
sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi
oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang
gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh
recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.
E. Metode Penggunaan
1) Metode Penggunaan Alat
Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel
diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection
hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke
kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.
Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu
biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah,
dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan
komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di
bawah peak untuk mengetahui kadar analit.
Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan
least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan
HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva standar terlebih dahulu dengan
menggunakan larutan standar.
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama
analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat
waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom.

2) Metode Melihat Seluruh Proses Diagram Alir HPLC

 Injeksi sample
Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
 Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju
detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-
senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
  Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultra-violet.
 Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-
masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan
menyerap sinar UV. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X
yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar
komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat
sederhana).Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang
meskipun waktu retensi akan sama.

F. Contoh Analisa
HPLC kerap digunakan dalam industri farmasi atau laboratorium farmasi sebagai
metode analisis sampel. Namun HPLC juga memiliki kegunaan dalam bidang lain seperti
pada industri makanan dan minuman, analisis lingkungan, forensik, serta pada tes klinis.
Dalam bidang farmasi, HPLC dapat digunakan untuk menguji stabilitas obat, uji
disolusi, serta quality control. Sedangkan pada industri makanan dan minuman, HPLC
dapat digunakan pada beragam analisis seperti untuk analisis keberadaan senyawa
polisiklik, analisis kadar gula dan pengawet, atau pengukuran kualitas minuman ringan dan
air. Pada bidang lain, HPLC dapat pula digunakan untuk analisis antibiotik dalam darah,
analisis kokain pada urin, dan sebagainya.
Contoh analisa penggunaa HPLC dapat dilihat pada jurnal yang berjudul “Validasi
Metode HPLC untuk Penetapan Aspirin dan Asam Salisilat dalam Plasma Kelinci (Lepus
curpaeums) secara Simultan” pada halaman selanjutnya