NEFELOMETRI

Prinsip kerja :

Nephelometry menitik beratkan pengukuran pada jumlah cahaya yang

disebarkan (scaterred) dari kuvet yang mengandung suspense partikel
dalam suatu cairan (solution)

Komponen-komponen dari nefelometer itu sama dengan komponen yang

terdapat pada spectrometer cahaya kecuali pada detector yang ditempatkan
pada sudut yangkhusus dari sumber cahaya.

Detector merupakan sabuah tube fotomultiplier yang ditempatkan pada

suatu posisi untuk mendeteksi cahaya yang tersebar. Detektor bisa
ditempatkan pada sudut 90o, 70o or 37o tergantung pada sudut mana paling
banyak ditemukan cahaya yang disebarkan

Karena jumlah cahaya yang disebarkan jauh lebih besar daripada yang
diteruskandalam suspensi turbid, maka nefelometri memiliki tingkat
sensitifitas yang lebih tinggi daripada turbidimetri

Jumlah cahaya yang disebarkan, bergantung pada jumlah dan ukuran

partikel yang tersuspensi

Sebagian besar aplikasi klinis, sumber cahayayang digunakan adalah

lampu tungsten, dimana tungsten memberikan cahaya dalam daerah visible

Untuk snsitivitas yang lebih tinggi dan untuk aplikasi penentuan ukuran
dan jumlah partikel dalam suspense, digunakan laser light nephelometer

Digunakan secara luas untuk menentukan konsentrasi zat yang tidak

diketahui dimana terdapat reaksi antigen-antibody seperti :

Penetuan immunoglobulin (total, IgG, IgE, IgM, IgA) di dalam serum dan

cairan bilogi lainnya

o

Penentuan konsntrasi serum protein individu; Hb, Haptoglobin,

Transferring, c-reaktif protein, 1-antitrypsin, albumin (dengan
menggunakan antibody spesifik untuk setiap protein)

Penetuan ukuran dan jumlah partikel (dengan laser nephelometer)

Pertimbangan antara turbidimetri dan nefelometri

Reaksi dalam turbidimetri dan nefelometri tidak mengikuti hukum Beer

(Beers Law) sehingga, kurva standard harus diplot dan konsentrasi dari
zat yang akan dicari (sample) ditentukan dari kurva standard

Karena absorbansi bergantung pada jumlah dan ukuran partikel, larutan

standard yang digunakan untuk kurva standard harus memiliki ukuran
yang sama sesperti dalam suspensi yang terdapat sampel.

Karena sejumlah precsipitasi dan settlement partikel bisa terjadi seiring

berjalannya waktu, maka untuk mendapatkan hasil dengan tingkat akurasi
yang bagus

Nefelometri merupakan metode yang digunakan untuk pengukuran kadar zat

dengan mengukur pendaran cahaya (scattered) yang mengenai partikel dalam
larutan, sedangkan alat yang dipakai adalah nefelometri. Dasar dari pemeriksaan
ini adalah reaksi presipitasi antigen-antibodi klasik yang digambarkan oleh
Heidelberger dan Kendall.
Alat ini digunakan untuk mengetahui kuantitas protein spesifik secara Lebih
akurat dan precise, selain itu mudah digunakan dan otomatis.

Sensitivitas dan spesifisitas yang baik menjadikan nefelometri dipakai sebagai

metode standar.
SampeI dengan jumlah minimal dapat diukur dengan alat ini.
Penggunaan nefelometri umumnya untuk mengukur protein plasma seperti
imunoglobulin, komponen komplemen, dan protein spesifik yang lain seperti free
light chain.

PRINSIP NEFELOMETRI
1. Pendaran cahaya
Pada metode nefelometri mengukur pendaran cahaya yang mengenai partikel pada
sudut tertentu. Pendaran cahaya dalam imunonefetometri dipengaruhi oleh
diameter partikel dan panjang gelombang. Partikel kecil seperti albumin, lg G, dan
Ig M (d < 0,05 )menghasilkan pendaran cahaya Rayleigh yang simetris pada
forward dan backward dari partikel. Pendaran cahaya minimum dilihat pada 90 0
dari sumber cahaya. Bila molekul yang lebih besar seperti komplek Ag-Ab,
pendaran dilihat dari depan (forward) dengan sudut mendekati nol, sehingga
pendaran cahaya mempunyai intensitas yang lebih besar. Jadi sudut untuk
mendeteksi pendaran cahaya ikut menentukan sensitivitas, dimana intensitas
sumber cahaya makin kuat maka sudut yang dihasilkan makin kecil (arah
forward) berarti makin sensitif.
Deteksi pendaran cahaya pada sudut depan (forward) dengan laser sebagai sumber
cahaya menghasilkan sinyal yang lebih besar, sehingga sensitivitas nefelometri
menjadi lebih baik.

2. Kinetik cairan pada fase presipitasi

Interaksi antigen-antibodi dalam larutan dipengaruhi banyak faktor, terutama
konsentrasi. Interaksi awal adalah antigen berikatan dengan molekul antibodi.
Kebanyakan merupakan reaksi yang reversible. Bila jumlah antibodi berlebihan
dan antigen yang telah berikatan dengan antibodi optimal (polyvalent), maka
terjadi ikatan selanjutnya pada komplek antigen-antibodi yaitu bentukan lattice.
Sinar tampak (visible) yang mengenai bentukan lattice dapat menghasilkan
pendaran cahaya Rayleigh-Debye. Lattice maksimal terdapat pada zona ekivalen.
Nefelometer sering digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen pada keadaan
kelebihan antibodi (excess antibody), dimana terdapat jumlah lattice aggregate,
sehingga pendaran cahaya yang terukur sesuai dengan jumlah antigen pada
sampel.

Untuk mencegah terjadinya antigen berlebihan, maka lihat prosedur pembuatan

free antibody (di pabrik pembuatannya).

Perjalanan waktu reaksi immuno-precipitation.

(A) variasi intensitas pendaran cahaya terhadap
waktu, (B) rata-rata peningkatan pendaran
terhadap waktu

Background scattering dapat terjadi saat memasukkan sampel yang telah

ditambah larutan dapar ke dalam kuvet. Hal ini dapat dikarenakan adanya protein
dan lipoprotein dalam sampel, partikel / debu pada reagen atau stray light.
Keadaan yang mengganggu pengukuran ini dapat diperkecil dengan menggunakan
nephelometry grade antisera dan pengenceran sampel.
Rata-rata peningkatan pendaran cahaya dan tingginya plateau yang tampak pada
gambar diatas berhubungan langsung dengan konsentrasi antigen dan pengenceran
antiserum. Nefelometri yang berdasar pada reaksi antigen-antibodi dan plateau
digunakan pada metode kinetik dan end-point, terutama untuk menentukan
konsentrasi antigen.
Interaksi Ag-Ab dipengaruhi oleh afinitas dan aviditas antiserum, bufer, pH,
kekuatan ionik larutan yang diperiksa. Adanya hydrophilic polymer dan nonionic
juga berpengaruh pada interaksi tersebut. Molekul polymer bersifat lebih

hidrotilik daripada Ag dan Ab sehingga menarik air pada antigen dan antibodi
yang dapat menyebabkan peningkatan reaksi antigen-antibodi.
PEG (polyethylene glycol) sering digunakan pada pemeriksaan dengan
nefelometer karena mempercepat laju reaksi, meningkatkan slope pada kurva
presipitin pada antibody excess zone dan membuat konsentrasi antigen menjadi
lebih tinggi pada equivalence zone.
METODE NEFELOMETRI
Metode nephelometri ada 4 yaitu endpoint dan kinetik yang sering digunakan,
sedang 2 lainnya yaitu partikel-enhanced dan inhihisi. Endpoint digunakan saat
telah tercapai keseimbangan Ag-Ab atau pada pengukuran tunggal dimana
perubahan rate sangat kecil, sedangkan kinetik untuk membandingkan terhadap
nilai referensi untuk mengetahui perlu tidaknya dilakukan pengenceran.
Metode kinetik dan endpoint dalam mengukur konsentrasi antigen dalam sampel
berdasar pada reaksi antigen-antibodi dan plateau stage.

A. Endpoint Nephelometry
- Tahap pemeriksaan meliputi :
1. reagen, sampel dan antisera dicampur,
2. back-ground signal diukur,
3. inkubasi campuran tadi sampai didapat keadaan plateau,
4. plateau atau endpoind signal diukur,
5. sinyal terakhir disebarkan setelah back-ground interference dikoreksi,
6. konsentrasi antigen ditentukan dengan kurva kalibrasi.
- Back-ground interference menyebabkan sensitivitas menurun.
- Afinitas dan aviditas antisera menentukan waktu inkubasi dan ketinggian
plateau yang dicapai pada tiap pemeriksaan.
B. Kinetic Nephelometry
- Rata-rata puncak pendaran sinar terjadi kurang dari 1-2 menit.

- Kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi antigen, afinitas dan titer

antisera.
- Waktu yang diperlukan untuk mencapai puncak reaksi berbanding terbalik
dengan konsentrasi antigen sampel.
- Reaksi imun komplek tidak memerlukan waktu inkubasi yang lama untuk
mencapai plateau.
- Metode ini umumnya memerlukan anti-serum yang afinitas dan aviditasnya
lebih besar dari metode endpoint.
- Sensitif terhadap pH, buffer, dan beberapa polymer (polymer enchancers).
- Lampu konvensional dengan bandwidth yang lebar menghasilkan laju reaksi
yang lebih banyak dibanding dengan laser.
- Sinyal pendaran dari laser dengan panjang gelombang tunggal lebih mudah
mendeteksi perubahan ukuran komplek imun pada stadium formasi yang awal.
C. Nephelometry Inhibition immunoassay (NIIA)
- Berat molekul hapten kurang dari 4000 dalton tidak dapat diukur secara
langsung dengan menggunakan nefelometer karena hapten monovalen
mencegah pembentukan lattice.
- Hapten yang terkonjugasi dengan protein carier dapat direaksikan dengan
antisera, langsung membentuk lattice yang bisa diukur dengan nefelometer.
Hapten membentuk kompek larut dengan antihapten-antiserum.
- Hapten ditambahkan pada campuran konjugat hapten dan antibodi hapten
spesifik yang jumlahnya terbatas, sehingga hapten mengikat antibodi dan
menghambat terjadinya bentukan lattice kanjugat hapten dengan antibodi.
- Jumlah pendaran cahaya berbanding terbalik dengan konsentrasi hapten dalam
sampel.
D. Particle-enchaced Immunoassay
- Partikel inert digunakan untuk membuat bentukan yang dapat menghasilkan
pendaran cahaya dari imunopresipitat.
- Latex polimer seperti latex polystyrene dengan diameter 0,1-0,2 m di coated
dengan antigen atau antibodi. Fragmen antibodi dan hapten dapat mengikat

permukaan partikel yang kemudian diukur oleh imunonefelometer atau indirect

competitive NIIA.
- Larutan dapar glisin dan surfaktan sering digunakan dalam reagen .

KOMPONEN NEFELOMETER
Komponen dasar nephelometry :
1. sumber cahaya,
2. collimating system untuk memfokuskan sinar,
3. monokromator,
4. kuvet,
5. photomultiplier tube.

Sumber cahaya dapat berupa lampu tungsten, lampu merkuri, lampu xenon, laser.
Panjang gelombang ikut berperan dalam pemeriksaan ini karena panjang
gelombang yang dibutuhkan tiap partikel bervariasi.
Nefelometer dengan karakteristik : intensitas tinggi, panjang gelombang tunggal,
sumber cahaya dengan panjang gelombang mendekati laser memberikan signal

yang besar, sehingga tidak perlu lagi collimating system karena pendaran cahaya
dipakai untuk menentukan ukuran partikel.
Lampu konvensional seperti tungsten mempunyai bandwidth lebih lebar,
menghasilkan sinyal yang proporsional dengan ukuran presipitat, sukar
mendeteksi perubahan ukuran partikel dan dapat mengukur gerak kinetik.
Dengan menggunakan reagen kusus maka kalibrasi dapat dilakukan alat , serta
mengikuti petunjuk di tiap reagen kita mengontrol pengoperasian alat.
Sinyal pendaran cahaya dikonversi menjadi konsentrasi dengan memakai curvefitting programe yang sebelumnya telah dibuat.
Alat dapat secara otomatis melihat keadaan kelebihan antigen, sampel diluar range
dan menyediakan instruksi untuk pemeriksaan ulang.

APLIKASI
Pemeriksaan yang sering dilakukan pada laboratorium meliputi imunoglobulin
(kit komersial yang tersedia : Ig G, A, M), komplemen (kit yang tersedia C3, C4),
CRP, dan protein serum yang lain.
Dapat pula untuk mengukur protein serum spesifik lain seperti faktor pembekuan,
protrombin, antiprotrombin, dan protein abnormal lain.