NEFELOMETRI

Nefelometri merupakan metode yang digunakan untuk pengukuran kadar zat dengan mengukur pendaran cahaya (scattered) yang mengenai partikel dalam larutan, sedangkan alat yang dipakai adalah nefelometri. Dasar dari pemeriksaan ini adalah reaksi presipitasi antigen-antibodi klasik yang digambarkan oleh Heidelberger dan Kendall. Alat ini digunakan untuk mengetahui kuantitas protein spesifik secara Lebih akurat dan precise, selain itu mudah digunakan dan otomatis. Sensitivitas dan spesifisitas yang baik menjadikan nefelometri dipakai sebagai metode standar. SampeI dengan jumlah minimal dapat diukur dengan alat ini. Penggunaan nefelometri umumnya untuk mengukur protein plasma seperti imunoglobulin, komponen komplemen, dan protein spesifik yang lain seperti free light chain.

PRINSIP NEFELOMETRI
1. Pendaran cahaya
Pada metode nefelometri mengukur pendaran cahaya yang mengenai partikel pada sudut tertentu. Pendaran cahaya dalam imunonefetometri dipengaruhi oleh diameter partikel dan panjang gelombang. Partikel kecil seperti albumin, lg G, dan Ig M (d < 0,05 )menghasilkan pendaran cahaya Rayleigh yang simetris pada forward dan backward dari partikel. Pendaran cahaya minimum dilihat pada 900 dari sumber cahaya. Bila molekul yang lebih besar seperti komplek Ag-Ab, pendaran dilihat dari depan (forward) dengan sudut mendekati nol, sehingga pendaran cahaya mempunyai intensitas yang lebih besar. Jadi sudut untuk mendeteksi pendaran cahaya ikut menentukan sensitivitas, dimana intensitas sumber cahaya makin kuat maka sudut yang dihasilkan makin kecil (arah forward) berarti makin sensitif. Deteksi pendaran cahaya pada sudut depan (forward) dengan laser sebagai sumber cahaya menghasilkan sinyal yang lebih besar, sehingga sensitivitas nefelometri menjadi lebih baik.

2. Kinetik cairan pada fase presipitasi

Interaksi antigen-antibodi dalam larutan dipengaruhi banyak faktor, terutama konsentrasi. Interaksi awal adalah antigen berikatan dengan molekul antibodi. Kebanyakan merupakan reaksi yang reversible. Bila jumlah antibodi berlebihan dan antigen yang telah berikatan dengan antibodi optimal (polyvalent), maka terjadi ikatan selanjutnya pada komplek antigen-antibodi yaitu bentukan lattice. Sinar tampak (visible) yang mengenai bentukan lattice dapat menghasilkan pendaran cahaya Rayleigh-Debye. Lattice maksimal terdapat pada zona ekivalen. Nefelometer sering digunakan untuk mengukur konsentrasi antigen pada keadaan kelebihan antibodi (excess antibody), dimana terdapat jumlah lattice aggregate, sehingga pendaran cahaya yang terukur sesuai dengan jumlah antigen pada sampel.

Untuk mencegah terjadinya antigen berlebihan, maka lihat prosedur pembuatan free antibody (di pabrik pembuatannya).

Perjalanan waktu reaksi immuno-precipitation. (A) variasi intensitas pendaran cahaya terhadap waktu, (B) rata-rata peningkatan pendaran terhadap waktu

Background scattering dapat terjadi saat memasukkan sampel yang telah ditambah larutan dapar ke dalam kuvet. Hal ini dapat dikarenakan adanya protein dan lipoprotein dalam sampel, partikel / debu pada reagen atau stray light. Keadaan yang mengganggu pengukuran ini dapat diperkecil dengan menggunakan nephelometry grade antisera dan pengenceran sampel. Rata-rata peningkatan pendaran cahaya dan tingginya plateau yang tampak pada gambar diatas berhubungan langsung dengan konsentrasi antigen dan pengenceran antiserum. Nefelometri yang berdasar pada reaksi antigen-antibodi dan plateau digunakan pada metode kinetik dan end-point, terutama untuk menentukan konsentrasi antigen. Interaksi Ag-Ab dipengaruhi oleh afinitas dan aviditas antiserum, bufer, pH, kekuatan ionik larutan yang diperiksa. Adanya hydrophilic polymer dan nonionic juga berpengaruh pada interaksi tersebut. Molekul polymer bersifat lebih hidrotilik daripada Ag dan Ab sehingga menarik air pada antigen dan antibodi yang dapat menyebabkan peningkatan reaksi antigen-antibodi. PEG (polyethylene glycol) sering digunakan pada pemeriksaan dengan nefelometer karena mempercepat laju reaksi, meningkatkan slope pada kurva presipitin pada antibody excess zone dan membuat konsentrasi antigen menjadi lebih tinggi pada equivalence zone.

METODE NEPIIELOMETRI
Metode nephelometri ada 4 yaitu endpoint dan kinetik yang sering digunakan, sedang 2 lainnya yaitu partikel-enhanced dan inhihisi. Endpoint digunakan saat telah tercapai keseimbangan Ag-Ab atau pada pengukuran tunggal dimana perubahan rate sangat kecil, sedangkan kinetik untuk membandingkan terhadap nilai referensi untuk mengetahui perlu tidaknya dilakukan pengenceran. Metode kinetik dan endpoint dalam mengukur konsentrasi antigen dalam sampel berdasar pada reaksi antigen-antibodi dan plateau stage.

Endpoint Nephelometry
- Tahap pemeriksaan meliputi : 1. reagen, sampel dan antisera dicampur, 2. back-ground signal diukur, 3. inkubasi campuran tadi sampai didapat keadaan plateau, 4. plateau atau endpoind signal diukur, 5. sinyal terakhir disebarkan setelah back-ground interference dikoreksi, 6. konsentrasi antigen ditentukan dengan kurva kalibrasi. - Back-ground interference menyebabkan sensitivitas menurun. - Afinitas dan aviditas antisera menentukan waktu inkubasi dan ketinggian plateau yang dicapai pada tiap pemeriksaan.

Kinetic Nephelometry
- Rata-rata puncak pendaran sinar terjadi kurang dari 1-2 menit. - Kecepatan reaksi tergantung pada konsentrasi antigen, afinitas dan titer antisera. - Waktu yang diperlukan untuk mencapai puncak reaksi berbanding terbalik dengan konsentrasi antigen sampel. - Reaksi imun komplek tidak memerlukan waktu inkubasi yang lama untuk mencapai plateau. - Metode ini umumnya memerlukan anti-serum yang afinitas dan aviditasnya lebih besar dari metode endpoint. - Sensitif terhadap pH, buffer, dan beberapa polymer (polymer enchancers). - Lampu konvensional dengan bandwidth yang lebar menghasilkan laju reaksi yang lebih banyak dibanding dengan laser.

- Sinyal pendaran dari laser dengan panjang gelombang tunggal lebih mudah mendeteksi perubahan ukuran komplek imun pada stadium formasi yang awal.

Nephelometry Inhibition immunoassay (NIIA)

- Berat molekul hapten kurang dari 4000 dalton tidak dapat diukur secara langsung dengan menggunakan nefelometer karena hapten monovalen mencegah pembentukan lattice. - Hapten yang terkonjugasi dengan protein carier dapat direaksikan dengan antisera, langsung membentuk lattice yang bisa diukur dengan nefelometer. Hapten membentuk kompek larut dengan antihaptenantiserum. - Hapten ditambahkan pada campuran konjugat hapten dan antibodi hapten spesifik yang jumlahnya terbatas, sehingga hapten mengikat antibodi dan menghambat terjadinya bentukan lattice kanjugat hapten dengan antibodi. - Jumlah pendaran cahaya berbanding terbalik dengan konsentrasi hapten dalam sampel.

Particle-enchaced Immunoassay
- Partikel inert digunakan untuk membuat bentukan yang dapat menghasilkan pendaran cahaya dari imunopresipitat. - Latex polimer seperti latex polystyrene dengan diameter 0,1-0,2 m di coated dengan antigen atau antibodi. Fragmen antibodi dan hapten dapat mengikat permukaan partikel yang kemudian diukur oleh imunonefelometer atau indirect competitive NIIA. - Larutan dapar glisin dan surfaktan sering digunakan dalam reagen .

KOMPONEN NEFELOMETER
Komponen dasar nephelometry : 1. sumber cahaya, 2. collimating system untuk memfokuskan sinar, 3. monokromator, 4. kuvet, 5. photomultiplier tube.

Sumber cahaya dapat berupa lampu tungsten, lampu merkuri, lampu xenon, laser. Panjang gelombang ikut berperan dalam pemeriksaan ini karena panjang gelombang yang dibutuhkan tiap partikel bervariasi. Nefelometer dengan karakteristik : intensitas tinggi, panjang gelombang tunggal, sumber cahaya dengan panjang gelombang mendekati laser memberikan signal yang besar, sehingga tidak perlu lagi collimating system karena pendaran cahaya dipakai untuk menentukan ukuran partikel. Lampu konvensional seperti tungsten mempunyai bandwidth lebih lebar, menghasilkan sinyal yang proporsional dengan ukuran presipitat, sukar mendeteksi perubahan ukuran partikel dan dapat mengukur gerak kinetik. Dengan menggunakan reagen kusus maka kalibrasi dapat dilakukan alat , serta mengikuti petunjuk di tiap reagen kita mengontrol pengoperasian alat. Sinyal pendaran cahaya dikonversi menjadi konsentrasi dengan memakai curve-fitting programe yang sebelumnya telah dibuat. Alat dapat secara otomatis melihat keadaan kelebihan antigen, sampel diluar range dan menyediakan instruksi untuk pemeriksaan ulang.

APLIKASI
Pemeriksaan yang sering dilakukan pada laboratorium meliputi imunoglobulin (kit komersial yang tersedia : Ig G, A, M), komplemen (kit yang tersedia C3, C4), CRP, dan protein serum yang lain. Dapat pula untuk mengukur protein serum spesifik lain seperti faktor pembekuan, protrombin, antiprotrombin, dan protein abnormal lain.

Cantoh : pemeriksaan serum free light chain

Protokol pemeriksaan sampel :

Serum Sample

Serum Protein Electrophoresis (SPE)

&

Freelite Kppa Lambda Kappa : Lambda ratio

Automated & Quantitative

Freelite anormal SPC normal

Freelite anormal SPC normal

Freelite normal SPC normal

Freelite normal SPC normal

Report Light Chain Paraprotein

Report Paraprotein present. Intact immunoglobulin or Light Chain Paraprotein

Report Paraprotein present. Intact Immunoglobulin

Report Paraprotein negative

Figure 4. A suggested screening protecol for B cell dyscrasia with the incorporation of serum FLC assays and the exclusion of urine sample tests.

Prinsip pemeriksaan :
Antibodi berikatan dengan kappa dan lambda free light chain yang sebelumnya telah diikatkan pada partikel latex. Kemudian direaksikan dengan sampel penderita yang mengandung free light chain, sehingga terjadi agregasi partikel latex yang meningkatkan kekeruhan. Kekeruhan diukur dengan analyzer dan dibandingkan dengan standar. Hasil dinyatakan dalam mg/L. Rasio konsentrasi free kappa/lambda dapat dihitung.

Nilai normal:
Kappa free light chains : 3,30-19,40 mg/L Lambda free light chains : 5,71-26,30 mg/L Rasio Kappa : lambda free light chain: 0,26-1,65

Interpretasi hasil pemeriksaan serum free light chain

Sector

Kappa

Lamdba

/ Ratio

Interpretation

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Normal Low

Normal Low

Normal Normal High Low

Normal serum BM suppression without Monoclonal Gammopthy Monoclonal Gammopathy Normal serum Monoclonal Gammopathy Normal serum Monoclonal Gammopathy Polyclonal Ig increase or renal impairment Monoclonal Gammopathy Monoclonal Gammopathy Monoclonal Gammopathy Polyclonal Ig increase or renal impairment Monoclonal Gammopathy with renal impairment

Normal High Normal Low Normal High High Low Normal High

Normal Low Low High Normal High Low Normal Low High High Normal Normal High Low

With bone marrow (BM) suppression

Without bone marrow (BM) suppression

Ig

= Immunoglobulin