TEKNIK PENGUKURAN FOTOMETRI

Dalam kimia klinik penggunaan fotometer untuk pengukuran secara fotometri

sangat banyak dan hampir semua pemeriksaan kimia darah selalu menggunakan
fotometer untuk menentukan kadar suatu zat terlarut dalam serum.

Fotometri merupakan teknik pengukuran menggunakan sinar, yang diukur adalah

penyerapan sinar atau pelemahan sinar yang diberikan akibat interaksi reaksi
antara sinar dengan panjang gelombang tertentu dilewatkan pada larutan zat
warna yang akan ditentukan kadarnya. Penyerapan disini biasanya disebut
absorbsi dan nilainya berupa absorben dalam angka desimal. Antara absorbsi dan
transmisi sinar berbanding terbalik, semakin tinggi absorbsi maka semakin rendah
nilai transmisi sinar yang diterima. Transmisi sinar biasanya disebut transmitted
dan nilainya berupa transmittan dalam persen (%).

TEKNIK PENGUKURAN

1. Kinetik (Kinetic)
Teknik pengukuran ini adalah pengukuran fotometris dari perubahan absorben per
satuan waktu baik menurun maupun meningkat. Pengukuran ini umumnya untuk
mengukur aktifitas enzim, namun dapat juga digunakan untuk pengukuran suatu
reaksi kimia yang kurang stabil seperti halnya kreatinin metode Jaffe kinetik 2
point. Kecepatan reaksi tersebut sangat tergantung dari suhu pengukuran, jumlah
substrat, aktifitas enzim, pH larutan, waktu dan zat inhibitor enzim.

a. Kinetik Enzimatik (3 point)

 Kinetik Menurun (Decrease Reaction/Falling)

Pengukuran kinetik yang dilakukan untuk penentuan aktifitas enzim, yaitu

kecepatan enzim untuk merubah substrat dengan test UV. Pengukuran secara
fotometri aktifitas enzim berdasarkan penurunan absorben per satuan waktu.
Pengukuran ini disebut pengukuran 3 titik, yaitu titik awal, kemudian titik kedua
dan titik ketiga. Interval waktu dapat 20 detik (K-20) atau 60 detik (K-60).
Substrat yang digunakan berisi NADH, LDH, Asam keto gluratarat dan L-
alanine/L-aspartat dalam buffer pH 7,5. Dalam kebanyakan reaksi enzimatik, co-
enzim NAD dapat direaksikan menjadi bentuk reduksinya NADH atau
kebalikannya. NADH berlainan dengan NAD, mempunyai daya tembus yang
kecil sekali terhadap sinar UV dengan panjang gelombang tertentu (340 nm)
sehingga konsentrasi substrat atau aktifitas enzim dapat ditentukan melalui
pengukuran. Enzim yang dapat ditentukan cara ini antara lain : AST, ALT, LDH,
CK, HBDH dan Urea UV, dan lainnya.

 Kinetik Meningkat (Increase Reaction/Rising)

Pengukuran ini juga untuk mengukur kadar enzim yang melakukan aktifitas
merubah substrat pada sinar 405 nm. Pengukuran ini juga menggunakan teknik
pengukuran 3 titik seperti halnya decrease reaction diatas. Suatu larutan yang
umumnya berisi Para-nitrophenyl phosphate berwarna kuning muda diubah
menjadi p-nitrofenol yang berwarna lebih tua kuningnya. Kecepatan perubahan
warna dari muda menjadi tua inilah yang diukur sebagai aktifitas enzim. Enzim
yang dapat ditentukan aktifitasnya antara lain : ALP, ACP dan GGT.

b. Kinetik 2 Point
Pengukuran kinetik 2 point (2 titik) dengan cara melakukan pengukuran pada
awal, kemudian dilanjutkan pada 2 menit selanjutnya. Hasil pengukuran berupa
absorben rata-rata dikalikan dengan faktor kinetik akan didapatkan kadar bahan
uji. Teknik pengukuran ini digunakan pada pemeriksaan kreatinin metode Jaffe
without deproteinisasi. Kestabilan reaksi ikatan antara kreatinin dalam suasana
alkali dengan asam pikrat dipengaruhi oleh adanya protein dalam serum.

2. Titik Akhir (End Point)

a. Blanko

 Blanko Udara

Teknik pengukuran dengan cara mengukur udara sebagai blanko dan dilanjutkan
dengan pengukuran bahan uji. Dengan cara ini koreksi perubahan indeks bias
larutan masih kurang teliti. Cara ini biasanya dilakukan pada pemeriksaan cara
kinetik, yang mana tidak memerlukan perubahan indeks bias larutan, tapi
perubahan konsentrasi larutan per satuan waktu.

 Blanko Aquabidest

Cara pengukuran ini sebagai baseline digunakan aquabidest, sehingga saat

transmisi 100% atau aboserben 0,000 menggunakan medium aquabidest. Lalu
dilakukan pengukuran blanko reagent, standard dan sampel. Cara inilah yang
umum dilakukan pemeriksaan dalam kimia klinik rutin.

 Blanko Sampel

Cara ini dilakukan untuk mengurangi kesalahan akibat sampel yang berwarna atau
keruh, sehingga perlu dilakukan penambahan sampel pada larutan blanko
sehingga diukur sebagai blanko sampel. Cara ini digunakan pada pemeriksaan
bilirubin total dan direk. Kemudian dilakukan pengukuran sampel dan dikalikan
faktor maka didapatkan kadar bahan uji.

b. Faktor
Dalam bahasan ini membahas teknik pengukuran yang terkait dengan penggunaan
blanko, namun sebagai acuan hasil/konsentrasi sampel dikalikan dengan nilai
faktor. Cara ini efektif dan efisien dalam penggunaan reagensia, namun tidak
selalu menunjukkan hasil yang baik apabila fotometer yang digunakan tidak
lakukan penghitungan ulang faktor dengan bantuan standard atau bahan kontrol
apabila : lampu yang digunakan telah tua atau lebih dari 3000 jam sehingga
meredup, filter yang sudah tua, kuvet yang sudah memburam, pergantian merek
reagensia dan suhu pengukuran yang berbeda. Oleh sebab itu sebaiknya
penggunaan faktor ini diperbaharui secara berkala dengan bantuan standard atau
serum kontrol/darah kontrol. Istilah ini disebut grade, baik upgrade value atau
downgrade value dari faktor tersebut. Biasanya cara ini digunakan pada
pengukuran kadar hemoglobin cara cyanmethemoglobin.

c. Standard
Cara pengukuran ini juga terkait dengan penggunaan blanko, namun sebagai
acuan hasil/konsentrasi sampel berdasarkan hasil perkalian silang absoben sampel
dengan konsentrasi standard dibagi dengan absorben standard. Cara lebih baik
dibandingkan menggunakan faktor, namun yang paling berpengaruh adalah
konsentrasi standard harus stabil dan memiliki simpangan baku (SD) dibawah 5%
atau 1% tergantung parameter yang digunakan. Adanya kekeringan larutan
standard akibat penyimpanan dalam suhu kulkas 2-8C karena terjadi penguapan
menyebabkan lebih pekat sehingga kadar standar tinggi yang berakibat kadar
sampel lebih rendah. Usaha untuk mengkoreksi dengan bantuan serum kontrol
ketelitan dan ketepatan. Dikenal teknik pengukuran ini berdasarkan jumlah
standar yang digunakan terdiri atas :

 Tunggal

Apabila pengukuran hanya berdasarkan atas 1 standar saja.

 Multipel

Apabila melebihi 1 standar dalam pengukuran. Biasanya ini digunakan pada

pembuatan kurva kalibrasi standar. Apabila dideret standar tadi dengan kosentrasi
yang rendah menuju tinggi, maka akan diperoleh kurva linear dengan kemiringan
(slope) 45lurus, yang berarti pengukuran telah tepat dan baik. disamping itu akan
diperoleh intercept dan coefisien variasi yang baik juga

3. Panjang Gelombang
Panjang gelombang (wavelenght) yang digunakan dalam pengukuran sangat
penting dalam kimia klinik, hal ini karena kesalahan penggunaan panjang
gelombang akan berakibat kesalahan pengukuran. Pada umumnya fotometer
semiotomatik dan full analyzer telah diset parameter dan panjang gelombangnya
sehingga kesalahan ini dapat ditiadakan.

Pada prinsipnya dalam pengukuran secara fotometer digunakan panjang

gelombang dengan serapan maksimum, sehingga sinar yang diberikan akan
diserap secara maksimum oleh larutan tersebut dan sisanya akan ditangkap
detector. Berikut ini jenis panjang gelombang dan warna larutan yang diukur
dalam fotometer pada umumnya

1. Panjang gelombang 340 nm Sinar ultra violet Warna Larutan Tidak

berwarna berisi NADH, pemeriksaan secara enzimatik. (AST, ALT)
 2. Panjang gelombang 405 nm Sinar biru Warna Larutan Larutan warna
kuning, baik enzimatik (p-nitrophenyl phosphate) contoh : (ALP, ACP,
GGT)
3. Panjang gelombang 492 nm Sinar biru muda Warna Larutan Larutan
orange/jingga, pemeriksaan kinetik kreatinine Jaffe without deproteinisasi.
4. Panjang gelombang 546 nm Sinar hijau Warna Larutan Larutan merah,
biru (kadang). pengukuran teknik end point sampel. Contoh : glukosa,
cholesterol, asam urat, kreatinin deproteinisasi.
5. Panjang gelombang 578 nm Sinar kuning Warna Larutan Larutan hijau,
biru, ungu dan kekeruhan putih dengan cara end point. Contoh : urea,
albumin, kalium turbidity.
6. Panjang gelombang 624 nm Sinar orange merah Warna Larutan
Larutan biru tua dan ungu. Jarang digunakan dalam kimia klinik.

Laboratorium Klinik
Artikel mengenai laboratorium klinik

Kimia Klinik terdiri dari :

1. Kimia Klinik
2. Hematology
3. Urinalisa
4. Serologi – Immunologi
5. Mikrobiologi
6. Bank Darah
7. Patologi Anatomi

Kimia Klinik

Pemeriksaan darah melalui reaksi kimia, yang dilakukan dengan cara manual,
semi otomatis atau Otomatis. Sampel yang digunakan pada pemeriksaan kimia
yaitu Serum atau Plasma.

Serum adalah Bagian cair darah yang didapat dengan cara darah didiamkan
sampai membeku kemudian dilakukan pemutaran dengan centrifuge dalam jangka
waktu yang telah ditetapkan.

Plasma adalah Bagian cair darah yang didapat dengan cara darah ditambahkan
dengan antibeku (anti koagulan seperti EDTA), kemudian dilakukan pemutaran
dengan centrifuge dalam jangka waktu yang telah ditetapkan.

Parameter reagent yang terdapat pada Kimia Klinik :

SGOT, SGPT, Alkaline Phosphatase, Gamma GT, Albumin, Total Protein,
Ureum, Creatinine, Uric Acid, CK-NAC, CKMB, Cholesterol Total, Triglyceride,
HDL-Cholesterol, LDL-Cholesterol, Amylase, Lypase, Bilirubin Total, Bilirubin
Direct, LDH, Glucose, dll.

Pemeriksaan Fungsi Hati :

SGOT, SGPT, Alkaline Phosphatase, Gamma GT, Albumin, Total Protein.

Pemeriksaan Fungsi Ginjal :

Ureum, Creatinine, Uric Acid, Creatinine Clearence Test (Bersihan Creatinine,

Sample menggunakan serum dan urine).

Pemeriksaan Fungsi Jantung :

CK-NAC, CKMB, Trop I / Trop T.

Pemeriksaan Profile Lemak :

Cholesterol Total, Triglyceride, HDL-Cholesterol, LDL-Cholesterol

Pemeriksaan Diabetes :

Gula darah (sewaktu, 2 jam, Hba1c (Kadar gula 3 bulan sebelumnya, GTT ).

Dalam reaksi kimia terdapat beberapa type reaksi yang dapat digunakan pada
pemeriksaan kimia ini diantaranya :

1. End Point ( Colorimetric )

2. Two Point ( Fixed Time )
3. Rate (Kinetic / Enzymatic )

End Point (Colorimetric)

Reaksi kimia antara Analyte dengan reagent yang menghasilkan kimia warna,
yang dibaca pada satu waktu tertentu (satu kali pembacaan). Kestabilan warnanya
antara 30-60 menit.

Jenis Pemeriksaan yang dapat dilakukan dengan type End Point (Colorimetric)
yaitu : Glucose, Cholesterol, Triglyceride, Ureum Barthelot, Uric Acid, Total
Protein, Albumin, Bilirubin, Ureum Barthelot, dll.

Two Point ( Fixed Time )

Reaksi kimia antara Analyte dengan reagent, yang dilakukan 2 (dua) kali
pembacaan absorbance (Penyerapan Cahaya). Perbedaan pembacaan pertama
dengan pembacaan kedua dipergunakan sebagai dasar perhitungan untuk
mendapatkan hasil pemeriksaan. Ketepatan waktu pembacaan akan berpengaruh
terhadap hasil pemeriksaan.

Jenis Pemeriksaan yang dapat dilakukan dengan type Two Point (Fixed Time)
yaitu : Creatinine, HDL-Cholesterol, Ureum uv, dll.

Rate ( Kinetic / Enzymatic )

Reaksi kimia antara analyte dan reagent dimana pengukuran dilakukan terhadap
aktifitas enzymes dalam reaksi tersebut. Pembacan Absorbance dilakukan tiap
menit selama 3 kali lalu diambil rata-ratanya. Rata-rata nilai Absorbancenya
dipergunakan sebagai dasar perhitungan untuk mendapatkan hasil pemeriksaan.
Ketepatan waktu pembacaan akan berpengaruh terhadap hasil pemeriksaan.

Jenis Pemeriksaan yang dapat dilakukan dengan type Rate (Kinetic) yaitu :
SGOT, SGPT, dll.