ANALISIS NAPZA

PDODI STR TLM

JURUSAN ANALIS KESEHATAN
POLTEKKES KEMENKES SEMARANG
A . M E T O D E I M U N O K R O M AT R O G R A F I
KOMPETITIF

Tes Skrining: Metode Imunokromatografi Kompetitif

Sampel : Urin
PRINSIP IMUNOGRAFI KOMPETITIF

Test didasarkan pada kompetisi penjenuhan IgG anti-narkoba yang mengandung substrat
enzim(ada dalam keadaan bebas di zone S) merupakan “Antibodi Pendeteksi dalam Strip”
oleh narkoba sampel/urine “Antigen dalam Sample” atau narkoba yang telah dikonjugasi
enzim “Antigen dalam Strip Test” (ada dan terfiksir di zone T). Jika dijenuhi oleh narkoba
dalam sampel (sampel positif narkoba), maka IgG anti narkobasubstrat tidak akan berikatan
dengan narkoba-enzimnya, sehingga tidak terjadi reaksi enzim-subtrat yang berwarna.
Sebaliknya jika tidak dijenuhi (sampel negatif narkoba) atau hanya sebagian dijenuhi (sampel
mengandung narkoba dalam jumlah di bawah ambang batas pemeriksaan/cut off value), maka
IgG anti-narkoba-substrat akan berikatan dengan narkoba-enzimnya secara penuh atau
sebagian, sehingga terjadi reaksi enzim-substrat yang berwarna penuh atau samar-samar.
 LANJUTAN PRINSIP

Valid tidaknya test dikontrol dengan mengikutsertakan pada zone S suatu

kontrol validitas yang berupa IgG goat-substrat. Karena IgG goat bukan
antibodi spesifiknya narkoba, maka baik pada sampel urin yang ada, ada
dalam jumlah di bawah ambang batas pemeriksaan atau tidak ada sama
sekali narkobanya, semuanya tidak akan menjenuhi dan hanya akan
mendifusikan IgG goat-substrat dari zone S ke zone C untuk menemui dan
mengikat IgG anti-IgG goat yang dikonjugasi enzim sehingga terjadi reaksi
enzim-substrat yang berwarna di zone C
 ALAT DAN BAHAN

Alat
• Tes strip narkoba

Bahan
• Urine
MACAM2 TES STRIP NARKOBA
 PROSEDUR

Biarkan strip test dalam suhu kamar

Buka penutup strip test, kemudian celupkan strip test tersebut secara
vertical kedalam sampel urine selama 10-15 detik

Saat dicelupkan strip test tidak boleh melewati batas garis yang paling
bawah Zona Sample (S)

Tempatkan strip test pada bidang datar, baca hasil setelah 5-10 menit
 INTERPRETASI HASIL
Positif : Hanya terbentuk pita pink pada Control (C)

Negative : Terbentuk dua pita pink pada Control (C) dan pada Test (T)

Invalid : Tidak terbentuk pita pink pada Control (C) dan pada Test (T) atau

terbentuk pita pink pada Test (T) sedangkan pada Control (C) tidak

terbentuk pita pink

B . U J I K R O M AT O G R A F I L A P I S T I P I S ( K LT )

Prinsip :

Residu hasil hidrolisa yang dilanjutkan dengan ekstraksi yang

dielusi dengan pelarut tertentu akan membentuk bercak yang
berwarna khas.
ALAT DAN BAHAN KLT
• Plate KLT (10x5 cm)
• Bejana Kromatografi (Chamber)

Alat
• Pipet mikrokapiler
• Botol semprot sprayer
• Lampu Uv

• Lapisan tipis silica gel

Baha • Eluen : pilih salah 1

• A. : Etil asetat-metanol-amonia-akuades (12 : 5 : 1 : 0.5)
• B : Kloroform-metanol-amonia (70 : 30 : 2)

n • Larutan penampak bercak (harus dibuat baru) :Larutan Fast Blue B Salt 0,1%
dalam air, apabila dalam air tidak timbul warna, dapat ditambahkan NaOH encer.
• Larutan Standar :Larutan 9-carboxy-THC 1 mg/mL dalam metanol
 KLT
• Hidrolisi alkali
• Pipet 10 ml urin kedalam tabung gelas bertutup, untuk pemeriksaan dengan KG ditambah standar internal.
Tambahkan 2ml kalium hidroksida 10 N, tutup tabung dan inkubasi pada 50oC selama 20 menit dengan sekali-kali
Hidrolisis diaduk. Lanjutkan dengan ekstraksi.

• Prinsip:Kokain diekstraksi dengan pelarut organik dalam suasana basa pada PH 8-9,5. Spesimen diatur pH sampai 9
(8 – 9,5) dengan buffer yang tepat. Hasil ekstraksi diuapkan, residu siap untuk pemeriksaan dengan alat KLT dan alat
KG.
Ekstraksi

• (1). Membuat Larutan Buffer :

• Buffer borax (PH 9-9,6)19,07 gr natrium tetraborat (Na2B4O7.10H2O) dalam 1 liter air
• - Buffer Ammonia (PH 9,5) :10,7 gr ammonium klorida dilarutkan dalam 40 ml larutan ammonia 5 M tambahkan air
Cara suling sampai 1 L
Ekstraksi
 CARA EKSTRAKSI
(2) Spesimen urin sebanyak 20 ml diatur PH-nya sampai 9 (8-9,5) dengan

buffer.
(3) Dengan pelarut ekstraksi diklorometan – isopropanol (85 : 15 v/v) sebanyak 40 ml atau kloroform isopropanol (50:50
v/v) dua kali, tiap kali dengan larutan ekstraksi 20 ml.
(4) Diamkan lapisan memisah, lapisan air (atas) dan lapisan ekstrak organik (bawah). Apabila terjadi emulsi gunakan
kertas saring silikon
(5) Tampung ekstrak organic, saring melalui kertas saring yang berisi sedikit
natrium sulfat kering.
(6) Saringan dicuci dengan pelarut ekstraksi 5 ml, hasil ekstraksi diuapkan sampai kering dengan pompa vakum atau uap
nitrogen. Ekstrak siap dipakai untuk penetapan secara Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) dan Kromatografi Gas (KG).
 PROSEDUR KLT
(1) Ekstrak urin yang sudah dikeringkan dilarutkan dalam 50 ul metanol
(2) Totolkan 5-10 ul larutan standar dan hasil ekstraksi pada plate dengan jarak

2 cm, kemudian elusi dalam bejana kromatografi dengan salah satu larutan
eluen
(3) keluarkan plate dari bejana kromatografi kemudian dikeringkan
(4) pengeringan dapat dilakukan pada suhu kamar atau dalam oven pada suhu

1200C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower
(5) plate yang telah kering disemprot dengan larutan penampak bercak,

kemudian diamati dengan lampu UV

 INTERPRETASI KLT
Senyawa UV
Kokain Hitam
Benzoilecgonine Hitam
Ecgonine Negatif
 KROMATOGRAFI GAS

PRINSIP :

Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan

dengan

pelarut kloroform, metanol disuntikkan kedalam kromatografi gas dengan

kondisi tertentu sehingga dapat diketahui waktu retensi (Rt) luas area dan
puncak kromatografi yang dihasilkan.
A L AT D A N B A H A N K R O M AT O G R A F I G A S

• Vortex mixer

Alat
• Heating block
• Pipet mikro
• Kromatografi gas

Baha • Pentafluoropropionik anhidrida (PFPA)

• Pentafluoro-propanol (PFPOL)

n
• Etil Asetat
• Gas Nitrogen
• Larutan Standar kalibrasi
Pembuatan larutan kalibrasi :

Buat larutan induk 1 mg/ml dari kokain, BE dan ecgonine metil ester dari
internal tandar dalam methanol.

Siapkan larutan standar urin dari larutan induk yang mengandung kokain 0,5
ug/ml, benzoilecgonin dan ecgonine metil ester 0-25 ug/ml internal standar
= 25 ug/ml Larutan standar kalibrasi dikerjakan dengan cara yang sama
dengan spesimen
 C A R A K E R J A K R O M AT O G R A F I G A S

Ekstraksi (sama dg KLT)

Derivatisasi:

(1) Urin tambahkan 50 µl PFPA dan 25 µl PFPOL ke dalam ekstrak kering hasil
ekstraksi. Kocok di atas vortex mixer dan panaskan di atas heating block pada
suhu 90oC selama 15 menit.

(2) Biarkan tabung sampai dingin dan uapkan ekstrak spesimen sampai kering pada
suhu 480 C dengan aliran gas nitrogen, kemudian larutkan residu dalam 25 µl etil
asetat

(3) Injeksikan 1-2 µl larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi ke dalam injektor
(4) Derivat PFPA stabil dalam reagen 1 bulan dan 24 jam setelah
reagen diuapkan.
 P E M E R I K S A A N K R O M AT O G R A F I G A S

Kondisinya sebagai berikut :

(1) Detektor : NPD atau FID
(2) Kolom : Packed column *) :
i. Dimetil silikon (SE-30, OV-1)
ii. Fenil metil silikon, 50% fenil (OV-17)
(3) Suhu :
i. oven : 2200 C
ii. Injektor : 2200 C
iii. Detector : 3000 C
(4) Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 30 ml/menit
i. Hidrogen dengan kecepatan alir 30 ml/menit
ii. Cappilary Column yang sesuai
(Ditjenyanmed, 2004)
Terimakasih