A.

ISOLASI VIRUS PADA TELUR BEREMBRIO

Tujuan : Mengisolasi virus yang dicurigai dalam telur berembrio

Alat :

1) Alat peneropong posisi embrio

2) Pencil

3) Spuit steril 1 ml

4) Bor telur

5) Selotip/kutek/lilin

6) Inkubator

Reagen :

Desinfektan ( Alkohol 70% atau yodium)

Bahan :

Telur berembrio

Prosedur kerja :

a) Penyuntikan telur berembrio

Metode Penyuntikan Intra alantois

Prosedur kerja :

1. Intra Selaput alantois

 Digunakan telur berembrio umur 8-11 hari.

 Dekat dengan rongga udara di desinfektan dan dilubangi dengan bor telur.

 Menggunakan tuberculin syring dengan jarum berukuran 25 gauge (16 mm),

inokulum sebanyak 0,1 – 0,2 ml pertelur. Disuntik dengan hati-hati langsung ke
dalam selaput alantois. Jarum tidak boleh digerak-gerakkan ke samping untuk
menghindari sobeknya selaput korio alantois dan matinya alantois.

 Lubang bekas suntikan ditutup dengan kutek atau lilin dan telur diinkubasi di dalam
inkubator suhu 37C selama 3 – 7 hari
  Telur diperiksa setiap hari untuk melihat apakah ada embrio yang mati. Jika ada
embrio yang mati atau embrio yang masih hidup setelah periode inkubasi
dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam kulkas selama 1 jam.

 Telur didesinfeksi, kulit telur dipotong di atas batas rongga udara kemudian cairan
alanto amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol
atau beaker steril.

 Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk.

 Perubahan diamati seperti perdarahan di bawah kulit,udema,dan kerdil.

2. Intra Korio-alantois

 Digunakan telur berembrio umur 10 - 11 hari.

 Kulit telur dekat rongga udara dan sebelah samping didesinfeksi

 Kulit telur dibor, pengeboranharus hati-hati jangan sampai menembus selaput korio
alantois atau mengenai pembuluh darah

 Telur ditempatkan dengan poisisi horisontal, kemudian dibuat rongga udara tiruan
disamping dengan cara menyedot udara melaui lubang rongga udara

 Setelah lubang udara berpindah ke samping, lubang udara semula pada rongga udara
ditutup dengan kutek atau lilin

 Inokulum sebanyak 0,1-0,2 ml,dimasukkan vertikal masuk di atas selaput korio

alantois.lubang ditutup dengan kutek atau lilin

 Telur diinkubasi 37C selama 5607 hari dan diperiksa setiap hari untuk melihat
apakah ada embrio yang mati. Jika ada embrio yang mati atau embrio yang masih
hidup setelah periode inkubasi dikeluarkan dari inkubator dan didinginkan dalam
kulkas selama 1 jam

 Telur didesinfeksi, kulit telur dipotong dekat rongga udara kemudian cairan alanto
amnionik dipanen menggunakan pipet pasteur dan ditampung dalam botol atau
beaker steril.

 Embrio dikeluarkan dan diletakkan di dalam petri disk.

 Selaput korio alantois diambil dan diperiksa perubahan seperti udema, penebalan
dan bintik atau bercak putih (pock atau plak).

 Selaput korio alantois ini ditampung dengan cairan alanto amnionik tadi.

3. Intra kuning telur

 Digunakan telur berembrio umur 6-8 hari

  Telur diletakkan posisi tegak, kulit telur di atas rongga udara didesinfektan
kemudian dibor

 Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 25 mm, telur diinokulum dengan suntikan tegak
lurus masuk ke selaput kuning telur.disedot sedikit untuk memastikan jarum telah
masuk kuning telur

 Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 3-10 hari
atau sampai embrio menetas

 Telur diperiksa setiap hari.jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama
periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas

4. Intra amnionik

 Digunakan embrio telur umur 10-11 hari

 Posisi telut ditentukan dan diberi tanda dengan pensil

 Kulit telur di atas rongga udara didesinfeksi kemudian kulit telur dibor

 Menggunakan spuit 1 ml dengan jarum 22 gauge sebanyak 0,1-0,2 ml inokulum

disuntikan langsung menembus selaput amnionik. Jika jarum tepat masuk selaput
tersebut maka akan ada gerakan embrio menyentuh ujung jarum

 Lubang telur ditutup dengan kutek atau lilin dan diinkubasi 37C selama 2-4 hari

 Telur diperiksa setiap hari. Jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama
periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas 1 jam

5. Intra venous

 Digunakan telur berembrio umur 10-12 hari

 tentukan posisi pembuluh darah di bawah batas rongga udara

 kulit telur didesinfektan kemudian kulit telur dibor bentuk segitiga tepat di lokasi
pembuluh darah. Hati-hati jangan sampai menembus selaput korio alantois

 supaya pembuluh darah jelas terlihat, kulit telur diusap dengan sedikit aseton

 Menggunakan spuit 1 ml dan jarum 16 mm (25 gauge) inokulum dimasukkan

melalui pembuluh darah dengan arah ke rongga udara

 kulit telur ditutup kembali dengan potongan kulit telur semula kemudian ditutup
dengan selotip dan diinkubasi 37C selama 7 hari

 Telur diperiksa setiap hari. Jika ada embrio yang mati atau masih hidup selama
periode inkubasi maka segera dikeluarkan dan dimasukkan ke dalam kulkas
b) Memanen specimen dari telur terinfeksi

 Kulit telur didesinfeksi

 Kulit telur dipotong tepat di atas batas rongga udara

 Cairan alantois, amnionik, selaput korio alantois, selaput kuning telur dan embrio di
panen

 Perubahan pada selaput korio alantois yang diamati meliputi: penebalan, bercak-bercak
putih, perdarahan di bawah kulit embrio dan kekerdilan.

B. PEMBUATAN KULTURE JARINGAN

1. PEMBUATAN KULTURE JARINGAN CHICKEN EMBRIO FIBROBLAST (CEF)

Tujuan : Mengetahui cara pembuatan kulture jaringan CEF

Alat :

1. Pinset steril 7. Beaker glass

2. Gunting steril 8. Kasa

3. Petri disk 9. Spuit 5 ml,10 ml

4. Safety kabinet 10. Tabung Sentrifuge

5. Sentrifuge 11. Flash

6. Mikroskop

Bahan :

1. Telur ayam berembrio 9-11 hari

2. Media MEM 5-10 %

3. Serum Sapi

4. PBS AB

5. Alkohol 70 %

6. Trypsin 0,25 %
Prosedur kerja :

1. Cara Tanpa Pemanasan :

a) Tangan, sarung tangan, gunting, pinset, telur disterilkan dengan alkohol 70 %.

b) Telur dibuka tepat di atas rongga udara dengan menggunakan gunting, kemudian
diambil di bagian leher dengan menggunakan pinset, ambil embrio (dikerjakan di
ruang steril/safety kabinet)

c) Masukkan embrio ayam ke dalam cawan petri, kemudian dipisahkan dengan

memotong bagian kepala, sayap, kaki, dan viscera/isi perut embrio (bagian yang
dipotong ini dibuang).

d) Bagian tubuh embrio dicuci dengan larutan PBS AB beberapa kali (2-3 kali) untuk
menghilangkan sel darah merah, dipindahkan ke cawan petri yang lain.

e) Bagian tubuh digunting kecil-kecil, kemudian dituangi dengan larutan tripsin 0,25%.
Dihomogenkan dan dimasukkan larutan ini ke dalam tabung sentrifuge dengan
memipetnya dengan pipet steril.

f) Diputar dalam sentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm.

g) Dibuang bagian yang jernih, bagian yang keruh di tambahkan lagi dengan larutan
tripsin, lalu di sentrifuge kembali selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm,
ulangi pengerjaan ini sampai ± 3 kali.

h) Hasil sentrifuge yang terakhir diambil bagian yang jernihnya, kemudian dipindahkan
kedalam flask.

i) Ditambah larutan MEM 1-2 ml, kocok, disaring dengan kasa steril, filtrat ditambah
dengan larutan MEM 5 ml, kocok, ditambah serum sapi 2ml, homogenkan.

j) Diamati dibawah mikroskop, tampak sel-sel yang terpisah merata dan transparan.

k) Disimpan di dalam inkubator 37ºC 5% CO2, dilihat pertumbuhan selnya tiap hari
dengan mikroskop.

2. Dengan pemanasan :

Pengerjaan seperti cara di atas (a, b, c, d, e) cairan tadi dimasukkan ke dalam flask
dengan pipet steril kemudian di putar dengan magnetik stirer diatas hot plate. (jangan
terlalu panas).
 2. PEMBUATAN KULTUR JARINGAN (TISSUE CULTURE) DARI SEL HATI
DAN GINJAL ANAK AYAM

Tujuan : Mengetahui cara kulture jaringan sel hati dan ginjal anak ayam

Alat :

1. Petridisk 6. Mikroskop

2. Sentriufuge 7. Pinset steril

3. Tabung sentrifuge 8. Spuit

4. Beaker glass 9. Botol/flask

5. Pipet tetes

Bahan :

1. Anak ayam umur 2-3 hari 4. Serum sapi

2. PBS AB 5. Alkohol 70%

3. Larutan MEM 6. Larutan Tripsin

Prosedur kerja :

 Anak ayam yang sudah disembelih disemprot/disterilkan dengan alkohol 70%.

Kemudian di bedah, bagian ginjal diambil dan dipindahkan ke petridisk.

 Dicuci dengan larutan PBS AB sebanyak 2-3 kali.

 Ginjal digunting kecil-kecil dalam media PBS AB tadi, kemudian ditambah larutan
tripsin.

 Dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge, dan di putar dalam sentrifuge selama 10

menit dengan kecepatan 2500 rpm.

 Cairan atas dibuang dan endapan diambil. Ditambah larutan tripsin, lalu diputar lagi
(ulangi pengerjaan ini sebanyak 2-3 kali).

 Cairan atas dibuang dan endapan dicuci dengan PBS AB.

 Dipindahkan ke dalam flask, ditambahkan larutan MEM sebanyak 1-2 ml, kocok,
disaring dengan kasa steril, lalu ditambah larutan MEM lagi sebanyak 5 ml dan serum
sapi 2 ml, homogenkan.

 Diamati di bawah mikroskop, akan tampak sel-sel transparan dan terpisah merata.
  Disimpan dalam inkubator 37°C dan setiap hari dilihat perkembangan selnya di bawah
mikroskop.

Cara Inokulasi sel :

 Setelah terbentuk satu lapis sel (monolayer) maka sel dicuci dengan PBS.

 Sampel dimasukkan dalam media dan biarkan 30 menit untuk terjadinya absorbsi.

 Sel ditambah dengan media dan diinkubasikan 2 atau 3 hari dengan diamati
sitopatologi efek (CPE)

 Pada sampel yang positif akan ditemukan: matinya sel, giant sel, atau negri bodies