1.

In Ovo
Metode ini merupakan penanaman virus pada telur ayam yang berembrio. Metode ini dapat
dilakukan dengan berbagai cara antara lain:
1. Inokulasi pada ruang chorioalantois
Biasanya digunakan embrio ayam dengan umur 10-12 hari. Jarum dimasukkan ¾ inci dengan
sudut 45º dan diinjeksikan 0,1-0,2 ml virus yang akan diinokulasikan. Setelah 40-48 jam cairan
telur yang sudah diinkubasi dapat diuji untuk hemaglutinasi dengan membuat lubang kecil pada
kerabang di pinggir dari rongga udara. Dengan alat semprot yang steril dan jarumnya, diambil
0,1-0,2 ml cairannya. Campur 0,5 cairan telur dengan perbandingan yang sama dari 10%
suspensi dari sel darah yang di cuci bersih dalam plate. Putar plate dan lihat aglutinasi setelah
1 menit. Cairan alantois yang terinfeksi dipanen setelah 1-4 hari inokulasi. Untuk mencegah
darah dalam cairan, embrio disimpan semalam dalam suhu 4ºC kemudian injeksi kerabang
dekat rongga udara dan buka kerabang tersebut dengan pinset steril. Membran ditekan ke atas
yolk sac dan cairan diambil dengan spuit dan dimasukkan ke dalam cawan petri. Kultur cairan
tersebut untuk menghindari cairan terkontaminasi bakteri.

Bahan yang dibutuhkan:

1. Telur: telur berembrio berumur 9 hari atau 10 hari.
2. Egg shell punch / Carborundum disc
3. Kapas
4. Spirit
5. 1 ml jarum suntik sekali pakai
6. Pita alat tulis (juga disebut selotip atau selotip)
7. Penangguhan virus dalam botol Beijenox
 8. Biohazard
Prosedur:
1. Usap ujung telur yang akan diinokulasi dengan etanol 70%. Biarkan alkohol menguap.
2. Tempatkan kapas bekas di baki buangan.
3. Nyalakan telur dengan obor LED intensitas tinggi dan tandai "X" di atas mata embrio.
4. Gambar garis pada shell yang menandai ruang udara.
5. Dengan pembobol kulit telur yang steril atau cakram karborundum menembus lubang di
ujung telur di tempat inokulasi yang ditandai.
6. Pasang jarum ke jarum suntik 1 ml.
7. Gambarkan 0,1 ml inokulum (suspensi virus) menjadi 1 ml jarum suntik.
8. Tempatkan jarum melalui lubang di kulit telur menjaga jarum dan jarum suntik vertikal.
Jarum harus menembus sekitar 16 mm ke dalam telur untuk mencapai lokasi inokulasi
tertentu.
9. Suntikkan 0,1 ml inokulum ke dalam telur.
10. Tarik jarum dari telur.
11. Tutup lubang cangkang dengan selotip atau lilin cair.
12. Buang jarum dan jarum suntik bekas pakai dalam kotak biohazard.
13. Tempatkan telur yang diinokulasi ke dalam inkubator kedua. Periksa suhu dan
kelembaban inkubator.
14. Dalam kasus inokulasi amniotik, ketika jarum mencapai embrio, dorongan akan
memukul embrio dan embrio akan menjauh dari jarum. Kemudian menyuntikkan
suspensi virus.

ISOLASI VIRUS
A. Kompetensi Dasar
Memahami akan manfaat melakukan isolasi virus dan tahapan inokulasinya
B. Indikator
1. Manfaat melakukan inokulasi virus
2. Menjelaskan sampel untuk bahan isolasi virus
3. Cara pembuatan inoculum
4. Menjelaskan tentang media untuk mengisolasikan virus
5. Menjelaskan tentang cara candling telur ayam bertunas
6. Menjelaskan tentang cara melakukan isolasi virus pada telur ayam bertunas
(TAB)
7. Menjelaskan tentang cara panen virus pada telur ayam bertunas

C. Materi
1. Manfaat melakukan inokulasi virus
Adapun manfaat melakukan isolasi virus diantaranya adalah untuk menemukan
agen penyebab penyakit. Disamping itu isolasi virus dapat dilakukan untuk
memperbanyak virus (misalnya untuk bahan pembuatan vaksin).
2. Sampel bahan isolasi virus
Pemilihan Sampel untuk Bahan Isolasi virus ND dan AI Bahan untuk isolasi virus
yang baik adalah jika sampel diambil dalam keadaan segar, diambil saat infeksi
 pada fase akut. Penyakit ND dan AI mempunyai gejala klisis yang sangat mirip,
yakni: kelainan sistema respirasi yang ditandai ngorok, keluar leleran hidung, batuk.
Gejala lain berupa gangguan sistim pencernaan yang ditandai: diare, bulu kusam
karena dehidrasi akibat diare profus. Ada pula gejala syaraf yang disebut tremor,
ataxia, tortikolis (tandanya sayap terkulai dan leher terpuntir ke belakang).
Perubahan patologi anatomi dari organ yang diakibatkan oleh kedua penyakit
tersebut juga hampir sama. Perubahan patologi anatomi ditandai dengan
perdarahan ringan sampai berat yang dijumpai pada trakea, paru-paru, usus,
provektrikulus, ventrikulus, dan otak. Perdarahan bentuk ptekie
(perdarahan bintik) maupun eksimosa (perdarahan yang meluas) seringkali
ditemukan pada organ-organ tersebut. Pada kasus AI perdarahan bintik juga
ditemukan pada pankreas, juga pada kaki.
Sampel untuk bahan pembuatan inokulum diambil dari organ-organ yang
mengalami perubahan menciri. Biasanya semakin menciri perubahan patologi
anatominya maka semakin tinggi pula titer virus hasil dipanen. Sampel organ
diambil dalam keadaan segar, dan usahakan pengambilan organ seseteril
mungkin. Organ ditempatkan di dalam tabung kaca steril selanjutnya dibuat
inokulum untuk diinokulasikan pada media isolasi virus.
Pada hewan yang masih hidup, sampel pemeriksaan dapat diambil dengan
menggunakan swab. Pada unggas diambil dari swab trakea, swab kloaka.
Pada mamalia juga dapat diambil dari swab kerongkongan, swab vagina, swab
preputium.
3. Cara Pembuatan Inokulum
a. Sampel berupa organ atau jaringan diambil sebanyak kira-kira 1 gram,
ditempatkan pada mortar steril, lalu dipotong kecil-kecil dan digerus
sampai halus sambil ditambahkan PBS pH 7,2 atau boleh juga NaCl
fisiologis sampai konsentrasinya 10-20 %.
b. Selanjunya suspensi jaringan dipindahkan ke dalam tabung steril untuk
disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 10-15 menit, kemudian
dipisahkan supernatant dari endapan.
c. Diambil bagian supernatan sebanyak 9 ml, ditambahkan dengan
antibiotika 1 ml yang sudah diencerkan (dengan dosis 1000-5000 IU
penicillin dan 1000- 5000 µg/ml streptomisin). Campuran tersebut
selanjunya dieramkan pada inkubator bersuhu 37ºC selama 30 menit.
d. Campuran supernatan yang berisi antibiotika tersebut selanjuntnya
digunakan sebagai bahan untuk isolasi virus pada tahap berikutnya
4. Media Isolasi Virus: Telur Ayam Bertunas
Media yang digunakan untuk isolasi virus antara lain: telur ayam bertunas (TAB),
biakan sel, hewan percobaan maupun hospes alami. Pada modul ini akan dibahas
tentang isolasi virus (sampel uji virus AI dan ND pada pembuatan inokulum point
2.d). Media yang umum digunakan untuk isolasi virus ND dan AI adalah telur ayam
bertunas (TAB). Alasan pemilihan telur ayam bertunas sebagai media isolasi Virus
ND dan AI, antara lain: a. Mudah diperoleh b. Relative bebas dari mikroorganisme
pathogen c. Peka terhadap infeksi virus ND dan AI d. Dapat diberikan tanda (ditulis
dengan pensil: kode isolat, asal isolat, tanggal inokulasi, jenis penyakit). Sebelum
digunakan telur diperiksa (candling) terlebih dahulu dengan menggunakan candler
(teropong telur).
5. Candling Telur Ayam Bertunas
Pemeriksaan telur ayam bertunas disebut candling yang dilakukan pada ruangan
gelap untuk mengamati pergerakan embrionya. Teropong telur (candler) dihidupkan
lalu telur diperiksa di depan Canler. Diamati pergerakan ambrio dan pembuluh
darahnya. Telur yang fertile ditandai dengan pergerakan aktif dan darahnya merah.
Sebaliknya telur yang infertile tidak ada pergerakan embrio dan pembuluh darahnya
tampak hitam. Telur ayam bertunas beserta bagian-bagiannya dimuat pada Gambar
1
6. Isolasi Virus pada Telur Ayam Bertunas
Jalur inokulasi yang umum dilakukan pada telur ayam bertunas diantaranya adalah:
a. inokulasi melalui ruang alantois b. inokulaasi melalui membrane korioalantois
(Chorioalantoic membrane= CAM) c. inokulasi kantong kuning telur (Yolk Sac) d.
inokulasi melaui ruang amnion (amnionic cavity) e. inokulasi melalui otak
(intracerebtum) f. inokulasi melalui pembuluh darah (intra vena) Pada modul ini akan
dijelaskan cara inokulasi virus melalui ruang alantois dan membrane korioalantois
(CAM).
a. Cara inokulasi virus melalui Ruang Alantois
Jalur inokulasi ini dipilih untuk virus: Newcastle Disease, Avian Influenza,
Infectious Bronchitis, Egg Drop Syndrome. Telur yang digunakan biasanya
berumur 9-10 hari. Jalur inokulasi adalah sebagai berikut: a. Telur di candling
untuk menentukan fertilatau tidak b. Ditandai ruang udaranya dengan
menggunakan pensil 15 c. Kulit telur didesinfeksi dengan alkohol 70%. d. Dibuat
lubang pada cangkang telur dengan menggunakan jarum penusuk e. Dilakukan
inokulasi 0.2 ml inokulum/ butir telur dengan menggunakan spuit dengan jarum
berukuran 1 ml. f. Lubang tempat suntikan tadi ditutup dengan menggunakan
kuteks g. Diberikan label pada telur tentang isolat yang diisolasikan. h. Telur
diinkubasikan di inkubator bersuhu 37ºC dan diamati setiap hari dengan cara di
canding i. Kematian telur kurang dari 24 jam diabaikan dan dianggap telur
terkontaminasi. j. Telur yang mati lebih dari 24 jam atau telur dengan embrio
yang sudah lemah selanjutnya dimasukkan ke almari pendingin selama satu
malam. k. Dilakukan pemanenen cairan alantois.
b. Cara Inokulasi Virus Melalui Membrana Korioalantois (CAM)
Inokulasi melalui membrane korioalantois dilakukan untuk mengisolasi virus –
virus yang bersifat epiteliotrofik, misalnya: virus Marek, Gumboro, Distemper,
Pox, Variola, Vaccinia. Biasanya pertumbuhan virus bersifat lambat yang
ditandai dengan pembentukan pox pada CAM. Cara inokulasi CAM: a. Telur
dipilih yang fertile dan berumur 11-13 hari b. Dilakukan candling dan ditandai
ruang udaranya dengan pensil. c. Dibuat satu tanda (x) dibagian horizontal yang
dekat dengan pembuluh darah. d. Kulit telur didesinfeksi dengan alkohol 70 %
kemudian dibuat lubang pada posisi ruang udara alami dengan menggunakan
jarum penusuk steril. e. Dibuat lubang satu lagi di bagian horizontal yang telah
diberikan tanda (point c). f. Udara dihisap keluar dari lubang ruang udara alami
(point d) untuk membuat ruang udara buatan pada lubang (point e) g.
Diinokulasikan 0,1 ml inokulum melalui ruang udara buatan, lalu lubang tadi
didesinfeksi dan ditutup dengan kutek h. Telur diinkubasikan pada inkubator
bersuhu 37ºC dengan posisi horizontal, dan diamati setiap hari selama maximal
5 hari. i. Telur dipanen dan dimasukkan ke almari pendingin.
7. Panen Virus
Telur yang sudah diinokulasi virus selanjutnya dikeluarkan dari almari pendingin
untuk dipanen. Sebelum dipanen disediakan alat-alat bedah yang terdiri dari:
gunting, pinset. Disiapkan pula cawan petri, tabung steril, spatula, pipet Pasteur,
sarung tangan dan masker, satu kantong plastik tempat menampung sampah bekas
panen.
A. Cara Panen Cairan Alantois
a. Telur dikeluarkan dari almari pendingin, lalu dipotong
cangkang telur pada bagian ruang udaranya secara
melingkar dengan menggunakan gunting. b. Dikuakkan
selaput korioalantoisnya dengan menggunakan pinset
sehingga tampak embrio yang dikelilingi cairan alantois
berwarna jernih. Apabila cairan alantoisnya tampak keruh
itu menandakan terjadi kontaminasi bakteri dan tidak layak
untuk diuji. c. Cairan alantois dipanen dengan cara diisap
dengan pipet steril dan ditampung pada tabung steril.
Embrio ditekan dengan spatula untuk mendapatkan cairan
yang bebih banyak, lalu cairan alantois ditampung pada
tabung steril kemudian diberi label untuk di uji HA/HI.
B. Cara Panen CAM
a. Telur dikeluarkan dari almari pendingin, lalukulit telur digunting
melingkar secara horizontal. 17 b. Embrio dikeluarkan dari
cangkang telur dan ditampung pada cawan petri steril c. Ambil
selaput CAM yang menempel pada cangkang telur
danditempatkan pada cawan petri lain yang telah diisi PBS. d.
CAM dicuci dengan PBS, digoyang-goyangkan sampai bersih dan
diamati adanya bentuk pox pada CAM. e. Bagian CAM yang
terinfeksi (bentuk pox) kemudian dipotong dan disimpan untuk
bahan uji pada PCR atau uji AGPT