Pemeriksaan Konfirmasi

Pemeriksaan konfirmasi adalah suatu pemeriksaan lanjutan yang lebih akurat karena hasil yang
dikeluarkan sudah definitif menunjukkan jenis zat narkotika psikotropika yang terkandung di dalam
sampel tersebut. Pemeriksaan dilakukan apabila hasil pemeriksaan pendahuluan (screening test) memberi
hasil positif.

A. Morfin dan derivatnya dalam spesimen manusia

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
1) Prinsip
Morfin dan derivatnya dalam spesimen manusia a. Kromatografi Lapisan Tipis
(KLT) 1) Prinsip Residu hasil ekstraksi yang dielusi dengan eluen tertentu kemudian
ditetapkan secara KLT sehingga terbentuk noda yang berwarna khas.
2) Alat :
a. Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari :
(1) Pipet kapiler
(2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm dengan ketebalan 0,25
mm
(3) Tabung elusi (developing tank)
(4) Lampu UV λ 254 nm
b. Spektrofotodensitometer
3) Reagen :
a. Lapisan Tipis Silika gel G
b. Eluen, pilih salah satu :
A : Toluen, Aseton, Etanol, Amonia pekat
B : Etil Asetat, Metanol, Amonia pekat
c. Larutan penampak noda :
Reagen Kalium Iodoplatinat yang diasamkan Larutan 0,25 g Platinat Klorida dan 5
g Kl dalam akuades sampai 100 mL, tambahkan 2 mL HCl pekat.
d. Larutan Standar Morfin, Kodein 1 mg/mL dalam methanol dalam bentuk garam
atau basanya.
4) Cara kerja
a. Hidrolisa dapat dilakukan dengan cara di bawah ini :
- Hidrolisa dengan asam : Dalam tabung bertutup volume 50 mL, masukkan 10 mL
urin tambahkan 1 mL HCl pekat campur hingga homogen. Buka tutupnya, inkubasi
didalam penangas air pada suhu 100° C selama 60 menit. Dinginkan, kemudian
dilanjutkan dengan ekstraksi.
b. Ekstrasi
Prinsip : Spesimen sebelum diekstraksi dihidrolisa terlebih dahulu, kemudian
diekstraksi dengan pelarut organik pada pH 8,5 – 9, hasil ekstraksi disaring dan
dikeringkan sehingga didapat residu yang dapat dianalisa secara kualitatif dengan
alat KLT dan kuantitatif dengan alat KG.
c. Pemeriksaan Kromatografi Lapisan Tipis
- pH urin diatur pada 8,5 – 9 dengan penambahan ammonia campur dalam vortex
mixer. Ekstraksi dengan salah satu pelarut organik yaitu, kloroform-isopropanol
(9:1 v/v), diklorometan-isopropanol (9:1 v/v), etil asetat, yang volumenya 2 kali
volume urin.
Ekstraksi dilakukan dengan pelarut organik 2 kali, tiap kali dengan 10 mL.
- Biarkan lapisan air memisah sempurna dari lapisan pelarut organik kumpulkan
lapisan organik.
- Apabila terjadi emulsi, saring dengan kertas saring silikon untuk menyaring
ekstrak. Pecahkan emulsi dengan sonikator.
- Supaya ekstrak dalam keadaan bening/bersih, ekstraksi kembali larutan organik
dengan 6 mL HCl 0,5 M.
- Tampung lapisan organik, pH lapisan air diatur pada 8,5-9, kemudian diekstraksi
kembali dengan salah satu pelarut di atas.
- Pisahkan lapisan organik, jadikan satu dengan lapisan organik sebelumnya, saring
larutan melalui sedikit Na2SO4 kering, cuci saringan dengan 5 mL fase organik.
- Pekatkan larutan sampai 1-2 mL dan uapkan pelarut di bawah gas nitrogen atau
dengan penangas air pada suhu tidak lebih dari 55 °C sampai kering. Pemekatan
dengan rotary evaporator atau Kuderna Danish Konsentrator. Untuk pemeriksaan
dengan Kromatografi gas pemekatan disarankan dengan KD Konsentrator.
Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar. Rf x 100 (Values) Noda yang
timbul dengan penampak noda
d. Pembacaan hasil :
 Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar.
Rf x 100 (Values)
Noda yang timbul dengan penampak noda

Senyawa UV Iodoplatinat Dragendrof

Morfin Flouresensi Biru-purple Oreange dengan latar
belakang kuning

2. Metode Kromatografi Gas (KG)

1. Prinsip Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan dengan
pelarut kloroform methanol disuntikkan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi
tertentu sehingga diketahui waktu retensi (R), luas area dan puncak kromatogram yang
dihasilkan.
2. Peralatan :
a) Derivatisasi
(1) Tapered tube (tabung runcing berskala) 10 mL
(2) Labu ukur 10 mL
b) Kromatografi Gas
3. Reagen :
a) Larutan standar kalibrasi Buat larutan induk morfin, Nalorfin dengan kadar 1
mg/mL dalam methanol. Dari larutan induk tersebut buat larutan standar kalibrasi
dalam akuades dengan konsentrasi antara 0-10 mg/mL morfin dan 5 mg/mL Nalorfin.
Nalorfin digunakan sebagai standar internal.
b) Derivatisasi
(1) BSA (N, O-bistrimetil silil asetamin)
(2) MSTFA (N, metil N-trimetilsilil trifluro asetamid)
(3) HMDS (Heksan metil disilasan)
(4) TMCS (Trimetil Klorosilan)
(5) Piridin
(6) PFTA (Penta Fluoro Propionat Anhidrat)
(7) Etil asetat
c) Kromatografi Gas
 (1) Gas nitrogen
(2) Kolom
4. Cara Kerja
a) Ekstraksi (Lihat Ekstraksi pada Metoda KLT)
Hasil ekstraksi kemudian diderivatisasi dengan cara sebagai berikut :
Sililasi :
(a) Ekstrak urin diuapkan sampai kering dengan uap nitrogen.
(b) Residu yang terbentuk diderivatisasi dengan 20 mL N,Obistrimetil sililasetamid
(BSA) dalam vial tertutup dengan pemanasan 85° C selama 15 menit (BSA
dapat diganti dengan campuran reagen silisasi dan piridin = 1:1 v/v 0.
Campuran tersebut disuntikkan ke dalam kromatografi gas. Jika dipakai
detector NPD, reagen sililasi seperti N-metil-N-trimetilsilil trifluoroasetamid
(MSTFA) atau campuran heksa metildisilasan (HMDS), trimetil klorosilan
(TMCS) dan piridin. Hasil derivatisasi diuapkan sampai kering dan dilarutkan
kembali ke dalam 50 µL toluen
(c) Derivatisasi harus dipersiapkan segera sebelum dianalisa, karena reagen
derivatisasi silil tidak stabil, 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil
derivatisasi diinjeksi ke dalam injector.
a. Pemeriksaan Kromatografi Gas Kondisinya sebagai berikut : -
- Detektor : FID atau NPD
- Kolom : Packed column *) 2 m x 2-4 mm ID - Dimetil silikon (SE 30,
OV-1)
- Fenil metil silikon, 50 % Fenil (OV-17)
- Suhu : Oven 230° C Injektor 275° C Detektor 275° C
- Gas : Nitrogen dengan kecepatan alir 70 mL/mnt *)
5. Pembacaan Hasil : Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.

3. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

1. Prinsip : Metabolit senyawa opiat dalam bentuk glukoronida di pecah/ hidrolisis
dengan enzim β-glukuronida (H. Pomatia) dengan cara inkubasi 55º C selama 2 jam
menjadi senyawa opiat bebas yang kemudian dilanjutkan ditarik dengan cara ekstrkasi
padat-cair dengan teknik SPE (solid phase extraction) dan mengubahnya menjadi
 senyawa yang mudah menguap (diderivatisasi) agar segera menjadi fasa gas pada
waktu diinjeksikan ke GC-MS dan untuk menaikkan sesitivitas atau memperbaiki
resolusi (KNNAP, 1979).
2. Alat :
a) Tabung Reaksi dengan tutup ulir 15 ml
b) Transferpet 1 – 10 ul, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml
c) Inkubator/penangas air
d) Vortex/minishaker
e) Kolom SPE C18
f) Pipet pasteur
g) Pipet pasteur
h) Tabung tutup asah
i) Turbo Vap LV
j) Gas Nitrogen
k) Sentifuse
l) Bath incubator
m) pH meter
n) Vial GC
m) GC/MSD
3. Reagen :
Semua bahan kimia harus pro-analisa

a) Larutan stok Morfin, Kodein, 6-Monoasetilmorfin (6-MAM)

masing-masing 1000 ppm dari Cerilliant, larutan Morfin, Kodein, 6-
MAM masing-masing 100 ppm dan 10 ppm
b) Larutan standar internal (ISTD) Nalorfin 1000 ppm,100 ppm dan 10
ppm
c) Larutan bufer asetat 2 M pH 5
d) Enzim β-glukoronidase (H. Pomatia)
e) Larutan KOH 1 M
f) Resin C-18 (Sep-Pak) dari Waters
g) Larutan bufer asetat 0.1 M
h) Metanol
 i) Aquabides
j) Etil asetat
k) Larutan penderivat BSTFA-TMCS [bis(trimetilsilil)trifluoro asetamida-
trimetilklorosilan (99 :1)]
4. Cara kerja :
a. Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 2 ml blanko
akuades, 2 ml blanko urin, 2 ml larutan standar campuran dalam urine,
dan 2 ml sampel urin
b. Ke dalam masing-masing tabung reaksi tambahkan berturut- turut 100
µl larutan ISTD Nalorfin 10 ppm, 100 µl bufer asetat 2 M pH 5, 25 µl
enzim β-glukoronidase (H. Pomatia)
c. Vortex sebentar, lalu inkubasi selama 2 jam pada suhu 55º C.
Dinginkan sebentar lalu tambahkan 80 µl KOH 1 M.
d. Siapkan kolom resin C18 , cuci dengan 2 ml Metanol dan 2 ml
Aquabides
e. Lewatkan sampel ke dalam kolom dengan menggunakan pipet pasteur.

f. Cuci kolom dengan 2ml aquabides dan 1ml bufer asetat 0.1M.
g. Elusi kolom dengan etil asetat (4 x 1 ml) dan tampung cairan dalam
tabung reaksi tutup asah.
h. Uapkan sampai kering cairan etil asetat dengan aliran gas nitrogen
dalam alat turbo vap pada suhu 35º C.
i. Tambahkan 50 µl larutan BSTFA-TMCS (99:1)
j. Inkubasi kering dengan alat thermoline pada suhu 60ºC selama 20 menit.
k. Masukkan hasil ke dalam vial lalu tutup
l. Siap diinjeksikan ke GC-MS
Kondisi alat kromatografi gas spektrofotometri massa
Metode : Scan
Kolom : Kolom kapiler, panjang 17 meter diameter 0,25 mm; film
thickness 0,11 µm
Suhu injektor : 280ºC
Suhu Detektor : 300º C
Suhu Oven : T0 : 140º C, dengan kenaikan 15º C /menit
 T1 : 260º C, dengan kenaikan 20º C /menit
T2 : 310º C, hold time 1 menit
Gas Pembawa : Helium
Laju Gas : 1.0 mL/menit, laju konstan
Volume Injeksi : 2 µl
Waktu Retensi : 6-MAM: 9.30 menit
Morfin: 8.98 menit
Kodein: 8.67 menit
ISTD Nalorfin: 9.63 menit
Run Time : 16 menit
Ion base peak dan ion lainnya untuk 6 MAM,Morphine,Codein dan
ISTD setelah dederivatisasi BSTFA-TMCS
Senyawa Ion base peak Ion 2 Ion 3
6-MAM-TMS 399 340 287
Morfin-TMS 429 236 178
Kodein-TMS 371 234 196
Nalorfin-TMS 455 414 -

Penafsiran hasil :
Kadar opiat dalam tubuh seseorang dan dalam urin ditentukan oleh metabolisme
obat, kondisi fisik subyek, asupan cairan dan cara masuknya obat ke dalam tubuh.
Biasanya opiat dapat dideteksi dalam urin sampai 3 hari.Karena jalur metabolik
yang sama, heroin, opium, kodein dan morfin sendiri dapat merupakan sumber
adanya morfin dan M-3-G dalam urin. Sumber lain dapat berasal dari Etil morfin,
folkodin, dan nikomorfin. Sehingga keberadaan morfin dalam urin tidak bisa
mengindikasikan jenis opiate yang dikonsumsi. Dalam hal kodein, telah
disepakati bahwa jika rasio kadar total kodein dibandingkan dengan total morfin
kurang dari 0,5 dan kadar total morfin dalam urin lebih besar dari 200
ng/mL,kodein dapat disingkirkan sebagai sumber morfin yang ada dalam urin.

B. Kokain dengan specimen manusia

1. Kromatografi lapis Tipis (KLT)
1) Prinsip dan alat sama seperti sebelumnya
2) Reagen :
a) Lapisan tipis Silica Gel G
b) Eluen, dipilih salah satu :
A:- Methanol 100 mL
- Amonia pekat 1,5 mL
B :- Methanol 10
- Kloroform 50 mL
c) Larutan Penampak Noda, dipilih salah satu :
(1) Reagen Dragendorf
- Larutan A : Campur 2 g Bismut subnitrat (Bismut Oksinitrat), 25 ml
asam asetat glacial atau pekat 100 mL air.
- Larutan B : Larutan 40 g Kl dalam 100 mL air.Campur 10 mL
larutan A dan 10 mL larutan B + 20 mL asam asetat glacial + 100
mL akuades
(2) Reagen Kalium Iodoplatinat yang diasamkan : Larutan 0,25 g platinat
klorida dan 5 g Kl dalam akuades sampai 100 mL tambahkan 2 mL HCl
pekat.
(3) Asam sulfat pekat 1 mL ditambahkan perlahan-lahan pada 10 mL larutan
ferri klorida (5 % w/v) dan campurkan.
d) Larutan Standar.
Larutan standar 1 mg/mL BE (Benzoylecgonin), kokain base dan
Ecgonin metil ester dalam methanol.
3) Cara kerja :
a. Ekstraksi :
Prinsip : Kokain diekstraksi dengan pelarut organik dalam suasana basa pada pH
8-9,5. Spesimen diatur pH sampai 9 (8-9,5) dengan buffer yang tepat. Hasil
ekstraksi diuapkan, residu siap untuk pemeriksaan dengan alat KLT dan alat KG.
a) Membuat larutan buffer
Buffer borax (pH 9-9,6)
19,07 natrium tetraborat (Na2B4Or10H2O) dalam 1 liter air. Buffer
Ammonia (pH 9,5)
 10,7 g ammonium klorida dilarutkan dalam 40 mL larutan ammonia 5 M
tambahkan akuades sampai 1 L.
b) Spesimen urin sebanyak 20 mL diatur pH-nya sampai 9
(8-9,5) dengan buffer.
c) Dengan pelarut ekstraksi diklorometan - isopropanol (85 : 5 v/v) sebanyak
40 mL atau kloroform isopropanol (50 : 50 v/v) dua kali, tiap kali dengan
larutan ekstrasi 20 mL.
Diamkan lapisan memisah, lapisan air (atas) dan lapisan ekstrak orgnik
(bawah).
Apabila terjadi emulsi gunakan kertas saring silikon.
d) Tampung ekstarak organik saring melalui kertas saring yang berisi sedikit
natrium sulfat kering
e) Saringan cuci dengan pelarut ekstraksi 5 mL, hasil ekstraksi diuapkan
sampai kering dengan pompa vakum atau uap nitrogen.
Ekstrak siap dipakai untuk penetapan secara Kromatografi Lapisan Tipis
(KLT) dan Kromatografi Gas (KG)
b. Kromato grafi lapis tipis
a) Ekstrak urin yang sudah dikeringkan dilarutkan dalam 50 µL methanol.
b) Totolkan 5-10 µL larutan satdar dan hasil ekstraksi pada plate dengan
jarak 2 cm, kemudian elusi dalam Tabung elusi dengan salah satu larutan
eluen.
c) Keluarkan plate dari Tabung elusi kemudian keringkan.
d) Pengeringan dapat dilakukan pada suhu kamar atau dalam oven pada suhu
120º C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari
blower.
e) Plate yang telah kering disemprotkan dengan larutan penampak noda,
kemudian diamati dengan lampu UV.
4) Pembacaan hasil :
Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar.
Rf x 100
Noda yang timbul dengan penampak noda

Senyawa UV Iodoplatinat Dragendorff

Kokain Hitam Ungu Orange
Benzoylecgonine Hitam Negatif Biru Orange
Eme Negatif Orange
 Penafsiran hasil pemeriksaan:
a) Waktu deteksi
Obat dalam bentuk aslinya dapat terdeteksi dalam urin sampai
24 jam dan metabolit benzoylecgonine dan ecgonine methyl ester sampai
48 jam. Pada pemakai kronik waktu deteksi dapat lebih lama sampai 5 hari
atau lebih. Dari pemeriksaan kokain dalam urin tidak dapat ditentukan
jumlah kokain yang dikonsumsi, waktu selang sejak konsumsi terakhir.
b) Perhatian
Ecgonine methyl ester dibentuk melalui aksi enzim pseudokolinesterase
sehingga bila ada kelainan dengan aktivitas enzim ini, pola ekskresi
metabolit akan berubah. Benzoylecgonine dapat terdeteksi dalam urin pada
konsumsi teh kokain sedangkan anhydroecgonine methyl ester dapat
terdeteksi setelah merokok kokain basa bebas (crack).
c) Analisis dan penafsiran hasil dalam spesimen manusia lain Konsentrasi
plasma kokain biasanya kurang dari 0,5 µg/mL sedangkan benzoylecgonine
0,1 µg/mL, pada kasus overdosis, kadar kokain dalam darah 1-20 µg/mL
dan benzoylecgonine 1- 10 µg/mL.
Kokain dan metabolitnya menunjukkan stabilitas yang buruk dengan
hidrolisis. Sampel darah dan plasma harus disimpan dalam tabung yang
mengandung sodium fluorida dan pH dibuat pH 5 dengan asam asetik (10
%, v/v), setelah itu dapat disimpan di kulkas pada 4º C atau dibekukan
untuk beberapa bulan.Sampel rambut dan air liur dari pengguna kokain
ditemukan mengandung kokain, untuk kadar dalam rambut belum ada
ketentuan sedangkan untuk kadar dalam air liur ditemukan berkorelasi
dengan kadar dalam plasma.
2. Kromatografi Gas (KG)
1) Prinsip KG sama seperti metode prinsip KG sebelumnya
2) Alat :

a) Vortex mixer
 b) Heating block
c) Pipet kapiler
d) Kromatografi gas
3) Reagen :

a) Pentafluoropropionik anhidrida (PFPA)

b) Pentafluoro-propanol (PFPOL)

c) Etil asetat

d) Larutan Standar Kalibrasi Pembuatan larutan kalibrasi :Buat larutan induk 1

mg/mL dari kokain, BE dan ecgonine metil ester dari internal standar
dalam methanol.Siapkan larutan standar urin dari larutan induk yang
mengandung kokain 0-5 µg/mL, BE dan ecgonine metil ester 0-25 µg/mL
internal standar = 25 µg/mLLarutan standar kalibrasi dilaksanakan cara
kerjasama dengan spesimen.

e) Gas Nitrogen

4) Cara kerja :

a. Ekstraksi (lihat ekstraksi Metoda KLT)

- Derivatisasi
a) Tambahkan 50 µL PFPA dan 25 µL PFPOL ke dalam ekstrak kering
hasil ekstraksi. Kocok di atas vortex mixer dan panaskan diatas heating
block pada suhu 90º C selama 15 menit.
b) Biarkan tabung sampai dingin dan uapkan ekstrak spesimen sampai
kering pada suhu 48º C dengan aliran gas nitrogen, kemudian larutkan
residu dalam 25 µL etil asetat. Injeksikan 1-2 µL larutan standar kalibrasi
dan hasil derivatisasi ke dalam injektor.
c) Derivat PFPA stabil dalam reagen 1 bulan dan 24 jam setelah reagen
diuapkan
b. Kromatografi Gas (KG)
 Kondisinya sebagai berikut :

- Detektor : NPD atau FID

- Kolom : Packed coloum*)

- dimetil silikon (SE-30, OV-1)

- fenil metil silikon 50 % fenil (OV-17)

- Suhu : - Oven 220º C

- Injektor 220 º C

- Detektor 300º C

- Gas : Notrogen dengan kecepatan alir 30 mL/menit Hidrogen

dengan kecepatan alir 30 mL/menit

*) Cappilary Column yang sesuai

5) Pembacaan hasil : Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar
c. Metode kromatografi gas spektrofotometri massa (KG-SM)
Hasil derivatisasi untuk pemeriksaan secara kromatografi gas dapat
dilanjutkan dengan menginjeksikan 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil
derivatisasi ke dalam injektor Kromatografi Gas- Spektrometri Massa (KG-SM).
Penafsiran waktu pemeriksaan :
a) Waktu deteksi
Obat dalam bentuk aslinya dapat terdeteksi dalam urin sampai
24 jam dan metabolit benzoylecgonine dan ecgonine methyl ester
sampai 48 jam. Pada pemakai kronik waktu deteksi dapat lebih lama
sampai 5 hari atau lebih. Dari pemeriksaan kokain dalam urin tidak
dapat ditentukan jumlah kokain yang dikonsumsi, waktu selang sejak
konsumsi terakhir.
b) Perhatian
Ecgonine methyl ester dibentuk melalui aksi enzim pseudokolinesterase
sehingga bila ada kelainan dengan aktivitas enzim ini, pola ekskresi
metabolit akan berubah. Benzoylecgonine dapat terdeteksi dalam urin
pada konsumsi teh kokain sedangkan anhydroecgonine methyl ester
dapat terdeteksi setelah merokok kokain basa bebas (crack).
c) Analisis dan penafsiran hasil dalam spesimen manusia lain Konsentrasi
plasma kokain biasanya kurang dari 0,5 µg/mL sedangkan
benzoylecgonine 0,1 µg/mL, pada kasus overdosis, kadar kokain dalam
 darah 1-20 µg/mL dan benzoylecgonine 1- 10 µg/mL.
Kokain dan metabolitnya menunjukkan stabilitas yang buruk dengan
hidrolisis. Sampel darah dan plasma harus disimpan dalam tabung yang
mengandung sodium fluorida dan pH dibuat pH 5 dengan asam asetik
(10 %, v/v), setelah itu dapat disimpan di kulkas pada 4º C atau
dibekukan untuk beberapa bulan.
Sampel rambut dan air liur dari pengguna kokain ditemukan
mengandung kokain, untuk kadar dalam rambut belum ada ketentuan
sedangkan untuk kadar dalam air liur ditemukan berkorelasi dengan
kadar dalam plasma.

C. Kanabis dalam spesimen manusia

1. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)
1) Prinsip
2) Reagen:
a) Lapisan tipis silica gel G
b) Eluen,pilih salah satu :
A: - Etil asetat 12
- Methanol 5
- Ammonia pekat 1
- Aquades 0,5
B : - Kloroform 70
- Methanol 30
- Ammonia pekat 2
c) Larutan penampak noda harus dibuat baru
0,1% larutan Fast Blue B Salt dalam air, apabila dalam air tidak timbul
warna dapat ditambahkan NaOH encer.
d) Larutan standar
Larutan 9-carboxy-THC 1 mg/mL dalam methanol
e) Gas Nitrogen

3) Cara kerja :
Persiapan sampel :
(1) Hidrolisa
Hidrolisa alkali.
Pipet 10 mL urin ke dalam tabung gelas bertutup, untuk
 pemeriksaan dengan KG ditambah standar internal. Tambahkan 2
mL kalium hidroksida 10 N, tutup tabung dan inkubasi pada 50º C
selama 20 menit dengan sekali-kali diaduk. Lanjutkan dengan
ekstraksi.
(2) Ekstrasi prinsip
9 karboxy THC dari urin yang telah dihidrolisa diekstraksi dalam
suasana asam. Hasil ekstraksi diuapkan pada suhu 35º-40º C.
Residu siap untuk pemeriksaan dengan KLT dan KG.

Cara ekstraksi ada 2 :

(1). Gair–cair
- Spesimen hasil hidrolisa setelah didinginkan, pindahkan ke
dalam corong pisah, pH diatur sampai 2 HCl 2 N atau H2SO4
2N
- Tambahkan 15 mL Sikloheksan-etil asetat (7 : 1, v/v)
- Ekstraksi dengan mengocok selama 10 menit
- Pindahkan lapisan organik, saring melalui natrium sulfat
kering ke dalam tapered tube, cuci saringan dengan 5 mL
pelarut (sikloheksan-etil asetat)
- Uapkan sampai kering pada temperatur kamar dengan aliran
udara atau gas nitrogen, larutkan kembali residu dalam 0,2
mL methanol atau asetonitril-methanol (3:1, v/v) dengan
pengocokan atau sonikator.
(2). Solid-phase (SPE)
- Kolom SPE yang sesuai dicuci dengan mengalirkan pelan-
pelan masing-masing 3 mL methanol, akuades, methanol
dan air.
- Plastic syring body 10 mL dipasangkan pada kolong
digunakan sebagai reservoir
Gunakan vakum dengan kecepatan rendah untuk menaikkan
kecepatan aliran.
Urin yang sudah dihidrolisa (2 mL) masukkan ke dalam
kolom, cuci dengan 10 mL HCl 0,1 N dan 25 mL larutan
asam fosfat 0,5 M dalam asetonitril 10 %.
- Elusi 9-carboxy-THC dengan 1 mL aseton
- Uapkan larutan dibawah aliran gas nitrogen, larutkan
 kembali dengan 0,1 mL methanol.
(3) Kromatografi lapis tipis

- Totolkan 5-10 µL larutan standar dan hasil ekstraksi pada

plate dengan jarak 2 em, kemudian elusi dalam Tabung
elusi dengan salah satu larutan eluen.
- Keluarkan plate dari Tabung elusi, kemudian plate
dikeringkan sebelum disemprotkan dengan penampak noda.
- Pengeringan dapat dilakukan pada suhu kamar atau dalam
oven pada suhu 120º C selama 10 menit atau dengan
menggunakan udara panas dari blower.
- Plate yang telah kering disemprot dengan larutan penampak
noda kemudian amati dibawah lampu UV.
4) Pembacaan hasil : Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar.
Rf x 100
B. Kromatografi Gas (KG)
1) Alat:

(1) Derivatisasi
- Tabung runcing berskala 10 mL
- Vortex mixer
(2) Kromatografi gas
2) Reagen:

a) Larutan standar internal

Siapkan larutan induk kanabinol 1 mg/mL dalam etanol absolut
1 mL larutan induk masukkan dalam labu takar 200 mL dan
tambahkan etanol absolut sampai tanda.
(1 mL larutan standar internal = 5 µ kanabinol)
b) Derivatisasi, dipilih salah satu :
(1) N,O - bis - trimethylsilyl - trifluoroacetamide (BSTFA) dan
trimethyl clorosilane (TMCS)
(2) Campuran tetra metil ammonium hidroksi (TMAH)
(a) dimetril sulfoxid (DMS)
(b) metil iodida
(c) HCl
c) Gas nitrogen
 4) Cara kerja :

a) Ekstraksi (lihat ekstraksi Metoda KLT)

Hasil ekstraksi kemudian diderivatisasi dengan cara sebagai berikut
:
(1) Ekstrak urin dalam tabung diuapkan sampai kering dibawah
aliran gas nitrogen, ditambah 50 µL BSTFA dan TMCS,
campur dengan menggunakan vortex mixer dan dipanaskan
pada suhu 60º C selama 10 menit.
(2) Residu yang didapat dilarutkan dengan 50µL dengan pelarut
organik
(3) Residu kering ditambah 70 µL 10 % TMAH-dimetil-sulfoksida
(1 ; 20 v/v), setalah 2 menit tambah 5 µL metil iodida.
(4) Setalah 10 menit tambah 200 µL 0,1 N HCl ekstraksi dengan 2
mL iso oktan.
(a) Lapisan iso oktan yang terpisah diuapkan dengan alran gas
nitrogen.
(b) Residu dilarutkan kembali dengan 50 µL pelarut organik
(c) Ambil 1-2 µL diinjeksikan ke dalam injektor
b) Kromatografi Gas
- Detector : FID
- Kolom : *) Packed Coloum 2 m x 2 mm ID
- 3 % dimetil silikon()OV-1)
- 3 % fenilmetil silikon 50 % fenil (V-17)
- Gas : Nitrogen/Helium dengan kecepatan alir 30mL/
mnt
- Suhu : - Injektor 210º C
- Oven 225 º C
- Detektor 275 º C
*) Cappilary Coloum yang sesuai (Lihat lampiran 5)

3. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

1) Prinsip : Metabolit senyawa kannabis dalam bentuk glukoronida-11-nor- delta-9
tetrahidrokannabinol-9karboksilat (9-Karboksi THC-Gluc) di pecah/hidrolisis
dalam suasana basa dengan cara inkubasi temperatur kamar selama 30 menit
menjadi senyawa 9-karboksi THC bebas yang kemudian dilanjutkan dengan cara
 ekstraksi alkilasi untuk mempermudah penguapan senyawa bersifat asam melalui
proses derivatisasi metil iodida dalam suasana basa, sehingga membentuk fasa
yang akan mengikat THA+. Senyawa yang terbentuk diekstraksi dengan touluen
dan selanjutnya kelebihan THA+ diabsorbsi oleh resin XAD 7 dan selanjutnya
turunan metil bersifat lebih polar ketampung untuk pemeriksaan GC-MS yang
sebelumnya diuapkan dan dilarutkan dalam etil asetat.
2) Alat :

a. Tabung reaksi dengan tutup ulir 12.5 ml

b. Transferpet 1 – 10 ul, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml,
c. Rotary Shaker
d. Vortex/minishaker
e. Kolom Resin XAD 7
f. Pipet pasteur
g. Turbo Vap LV
h. Gas Nitrogen
i. Sentifus
j. Vial GC
k. GC/MSD
3) Reagen :
Semua bahan kimia harus pro-analisa
a) Larutan induk
11-nor-delta-9tetrahidrokannabinol-9karboksilat 10 µg /mL, larutan induk
Internal Standard Mefruside 100 µg /mL
b) Enzim β-glukoronidase (H. Pomatia) dari SIGMA,
c) Larutan NaOH 1 M,
d) Larutan Tetraheksilammonium hidrogen sulfat 0.2 M dari Aldrich
e) Toluen
f) Metil Iodida
g) Kolom Resin XAD 7 dari Supelco
h) Metanol
i) Etil Asetat

4) Cara kerja :

a) Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 2 mL blanko

akuades, 2 ml blanko urin, 2 ml larutan standar spike 10
 µL 11-nor-delta-9tetrahidrokannabinol-9karboksilat 10 µg /mL
dan 2 mL sampel urin (duplo)
b) Tambahkan pada setiap tabung reaksi
c) 20 µL larutan Mefruside 100 µg/mL sebagai ISTD
d) 50 µL Natrium Hidroksida. 6 M, tunggu selama 30 menit untuk
hidrolisa
e) 100 µL Tetraheksilammonium hidrogen sulfat 0.2 M
f) 5.0 mL Toluen

g) 100 µL Metil Iodida

h) Tutup tabung reaksi dengan benar dan pastikan tidak bocor dan
kocok pada rotary shaker selama 1 jam
i) Sentifus selama 5 menit
j) Siapkan kolom resin, cuci masing-masing dengan 2 x 1 ml
metanol dan toluen
k) Pindahkan fasa organik dari tabung reaksi tersebut dengan pipet
pasteur ke dalam 2.5 – 3 cm kolom resin XAD-7 kolom resin
sambil dikumpulkan eluat ke dalam tabung reaksi berlabel. Setelah
selesai XAD-7 resin diregenerasi dengan 2 x 2 ml metanol.
l) Uapkan lapisan toluen sampai kering menggunakan peralatan
Turbovap 40º C yang dialiri gas Nitrogen selama 10 menit pada 15
psi
m) Larutkan residu yang telah kering dengan 100 µL etil asetat
n) Pindahkan larutan tersebut ke dalam vial GC yang berlabel dengan
penomoran dan siap untuk diinjeksikan ke GC-MSD.
5) Penafsiran hasil pemeriksaan
Waktu deteksi : Waktu metabolit dapat terdeteksi dalam urin
bergantung pada metode immunoassay dan batas deteksi. Biasanya
pengguna akut (kurang dari 2 kali seminggu) dapat terdeteksi dalam 1-
3 hari dalam urin ketika menggunakan metode dengan batas deteksi di
atas 100 ng/mL (atau kurang), untuk pengguna kronis waktu
deteksinya lebih lama, dapat lebih dari 1 minggu.
Inhalasi positif : Perokok pasif marijuana dapat terdeteksi melalui urin
bila menggunakan metode dengan batas deteksi 20 ng/mL, tetapi hal
ini jarang terjadi. Bila didapat kadar lebih dari 100 ng/mL,
 kemungkinan perokok pasif dapat disingkirkan.
Variasi kadar : Kadar obat dalam urin dapat berubah 10 kali lipat
dalam beberapa jam bergantung pada asupan cairan. Sehingga harus
berhati-hati menafsirkan kadar THC yang bervariasi di sekitar batas
deteksi, hasil yang negatif kemudian diikuti hasil positif belum tentu
berarti adanya penambahan konsumsi marijuana.

D. Amfetamin Dan Metamfetamin dalam spesimen manusia

1. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) 1)
1) Prinsip : Residu hasil ekstraksi yang dielusi dengan eluen tertentu sehingga
terbentuk noda dengan warna yang khas.

2) Alat :

1. Alat KLT
 Plat KLT (20 x 20 cm, 10 x 10 cm, 10 x 5 cm)
 Tabung elusi
 Pipa kapiler
 Botol semprot
2. Oven
3. Lampu UV

3) Reagen :

1. Lapisan Tipis Silica Gel G (lihat lampiran 4)

2. Eluen, pilih salah satu :
A : - Metanol 100 mL
- Amonia pekat 1,5 mL
B :
- Etil Asetat 85mL
- Metanol 10 mL
- Amonia pekat 5 mL
3. Larutan penampak noda, pilih salah satu :
(1) Fast Back K Salt :
Larutan A : Fast Back K Salt 1 % dalam
air.
Larutan B : Natrium hidroksida 1 M.
 (2) Ninhidrin
Siapkan larutan ninhidrin 10 % dalam etanol
(3) Reagen Fluoreskamin
Siapkan larutan 10 mg fluoreskamin dalam 50 ml aseton
(4) Simons :
Larutan A :Natrium karbonat encer 20 %
Larutan B :Natrium nitroprusid encer 1 %
4. Larutan Standar
Larutan standar amfetamin dan metamfetamin :
Siapkan larutan standar dalam metanol mengandung masing-
masing 5 mg/mL.
4) Cara Kerja
a) Ekstraksi
Prinsip : Amfetamin dan metamfetamin yang terdapat dalam urin
diekstraksi dengan pelarut organik sehingga terbentuk residu, yang
dapat dianalisis secara kualitatif dengan alat KLT atau kuantitatif
dengan alat KG.
Cara Ekstraksi:
- Masukkan 2 mL urin spesimen ke dalam tabung sentrifus 50 mL dan
0,25 mL larutan standar (larutan 2 metil feniletilamin : 8 µg/mL).
- Tambahkan 2 mL NaOH 1 M, air suling 5 mL dan diklorometan 20
mL dan kocok. Tabung ditutup, kocok sentrifus dengan kecepatan
rendah selama 5 menit, lapisan atas dibuang.
- Tambahkan 2 mL asam sulfat 0,15 M, tabung ditutup, kocok dan
sentrifus. Lapisan sir sebelah atas dipindahkan ke dalam tabung
sentrifus 15 mL tambahkan 1 mL natrium hidroksida 1 M dan 2,5 mL 1-
klorobutan atau diklorometan. Tutup tabung vortex dengan berat dan
disentrifus lapisan organik pindah ke dalam tabung yang bersih,
tambahkan 50 µL larutan metanolic asam klorida (9 : 1 v/v).
- Residu siap diperiksa dengan alat KLT atau alat KG. Ekstrak diuapkan
dengan vakum sampai kering.

b) Pemeriksaan Kromatografi Lapisan Tipis

- Hasil ekstraksi yang telah dikeringkan dilarutkan kembali dengan
metanol.
- Totolkan 5-10 µL larutan standard an hasil ekstraksi pada plat dengan
jarak 2 cm, kemudian elusi dalam tabung elusi dengan salah satu larutan
eluen.
- Keluarkan plat dari tabung elusi, kemudian sebelum disemprot dengan
larutan penampak noda.
- Pengeringan pada suhu kamar atau di dalam oven pada suhu 120°C
selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.
 - Plat yang telah kering disemprot dengan larutan penampak noda,
kemudian diamati dengan lampu UV.
- Penampak noda :
(1) Fast Black K Salt
- Semprot plat dengan larutan A dan amati warna noda, untuk amin
sekunder misalnya metamfetamin akan 136 segera menghasilkan noda.
Semprot dengan larutan B sedikit berlebih, akan menghasilkan warna
noda untuk amin primer misanya amfetamin.
- Keringkan plat pada udarang kering dan semprot sekali lagi dengan
larutan A, supaya menghasilkan noda yang lebih intensif - Warna
bervariasi dari ungu untuk amfetamin sampai merah muda untuk
metamfetamin.
- Batas deteksi untuk amfetamin dan metamfetamin adalah 0,05-0,1 µg.
5) pembacaan hasil : Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf Standar.
Rf x 100