Armydha Dwi S.,M.Sc.

 metode konvensional
test warna
kromatografi lapis tipis (KLT).
 metode modern
POCT (point of care test)
HPLC (high performance liquid
chromatography).
A. TES WARNA (COLOUR TEST)
untuk identifikasi obat-obatan dan racun,
residu, serta cairan biologis seperti isi perut,
dan urin.

Faktor-faktor Ekskresi dari tubuh dan

konsentrasinya dalam urin
 cara pemakaian,
 lama dan seringnya penggunaan,
 fungsi organ,
 kecepatan metabolisme obat,
 kondisi fisik dari subyek (umur, jenis kelamin)
 waktu pengambilan sampel,
 pengenceran dll
 Pemeriksaan screening hanya untuk
mengarahkan kemungkinan jenis zat yang
terdapat dalam sampel, sehingga hasilnya harus
dilanjutkan dengan tes konfirmasi karena zat
selain narkoba juga mempunyai kemungkinan
memberikan hasil yang sama (false positive).

 Untuk golongan benzodiazepin reaksi warna

tidak dianjurkan untuk dipakai karena jenis zat
dalam golongan ini sangat beragam,
pemeriksaan skrining yang dianjurkan adalah
kromatografi lapis tipis (KLT).

 Zat yang digunakan untuk pereaksi harus dijaga

mutunya untuk menjamin bahwa zat yang
digunakan tidak mengalami dekomposisi, yang
dapat merubah warnanya dan mengacaukan hasil
pemeriksaan.
 1. Sangat cepat dan murah, hanya menambahkan
reagen kemudian amati warna yang terbentuk
 2. Terutama berguna untuk urine atau cairan
lambung atau “residu kejadian”, misalnya tablet
atau serbuk
 3. Biasanya dilakukan dengan tabung reaksi
bening, tetapi plat tetes putih lebih baik (latar
belakang seragam, sedikit menggunakan
reagen).
 4. Harus selalu menganalisa banko reagen dan
kontrol positif dengan sampel
 5. Bersifat subjektif, orang berbeda dalam cara
mereka memandang atau mendeskripsikan
warna, warna juga bervariasi intensitasnya
 6. Banyak jenis tes yang tersedia, namun
sebagian besar memiliki selektivitas yang buruk
 1. Tes blanko sampel, adalah sampel yang diketahui
tidak mengandung senyawa yang diuji. Jika tes
dilakukan pada urin maka blanko urin (bebas analit)
harus digunakan, atau dapat digunakan akuades.
 2. Sampel positif yang mengandung analit dengan
konsentrasi yang diketahui. Jika tes dilakukan pada
urine, idealnya urin dari pasien atau sukarelawan yang
diketahui telah menggunakan senyawa yang
bersangkutan harus digunakan. Namun, hal ini tidak
selalu praktis dan kemudian urin 'spiked' (blanko urin
yang telah ditambahkan sejumlah senyawa yang
diketahui dalam analisis) harus digunakan.
 Tes warna berguna karena minimal peralatan
dan keahlian yang diperlukan, tetapi reagen
harus stabil. Tes ini sensitivitasnya terbatas
dan biasanya hanya berlaku untuk urin dan
atau sampel lain yang mengandung jumlah
racun dalam jumlah relatif besar, seperti isi
perut. Adalah mungkin untuk mengekstrak
racun dan menerapkan tes warna pada
residu, meskipun hal ini jarang dilakukan
untuk cairan biologis.
 a. Prinsip
Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan
formaldehid dalam suasana asam sulfat pekat

 Pereaksi Marquis
(Formaldehid 34-38% dan asam sulfat pekat 1:9 v/v)

 Untuk sampel urin

1) Masukkan 2 ml urin kedalam tabung sentrifus
2) Tambahkan NaOH 4N sampai pH 9-10
3) Ekstraksi dengan 5 ml eter, masukkan dalam vortex mixer
dan di sentrifus
4) Ekstrak eter dipisahkan dan diuapkan sampai kering
5) Residu dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% (secukupnya),
keringkan lagi
6) Tambahkan 1 tetes larutan perekasi

 Untuk pemeriksaan sampel obat atau makanan yang dicurigai

Letakkan 1-2 mg sampel bubuk/1-2 tetes bila berbentuk cairan ke
dalam lekukan plat tetes, tambahkan pereaksi, tak lebih dari 3 tetes.
 a. Prinsip
 Pembentukan senyawa berwarna antara zat
yang diperiksa dengan asam selenius dalam
suasana asam sulfat pekat

 Pereaksi Mecke: 0,25 gram asam selenium

larutkan dalam 25 mL asam sulfat pekat
panas
 a. Prinsip
 Pembentukan senyawa berwarna antara zat
yang diperiksa dengan asam
molibdat/natrium molibdat dalam suasana
asam sulfat pekat

 Pereaksi Frohde :
 1,0 gram asam molibdat/natrium molibdat
larutkan dalam 100 mL asam sulfat pekat
panas, larutan akhir harus tak berwarna
 a. Prinsip
 Pembentukan senyawa berwarna antara zat
yang diperiksa dengan reagen Simon dalam
suasana basa

 Pereaksi I = 20 % larutan sodium karbonat

dalam akuades,
 Pereaksi II = 50 % larutan asetaldehida
etanolik,
 Pereaksi III = 1 % larutan sodium nitroprusida
dalam akuades
 Prinsip
Sampel diekstraksi dengan petroleum eter, kemudian
direaksikan dengan Garam Fast Blue B membentuk
senyawa berwarna
 Reagen
 1) Reagen padat : Garam Fast Blue B (di-o-
anisidinetetrazolium klorida)
Encerkan Garam Fast Blue B dengan natrium sulfat
anhydrous (1 :100)
 2) Larutan I : Petroleum eter
 3) Larutan II : Larutan cair dari natrium bikarbonat 10
% (w/w)
 Prinsip
Sampel diekstraksi dengan kloroform, kemudian
direaksikan dengan Garam Fast Blue B membentuk
senyawa berwarna

 Reagen
 1) Reagen padat : Garam Fast Blue B (di-o-
anisidinetetrazolium klorida)
Encerkan Garam Fast Blue B dengan natrium
sulfat anhidrous (2,5 :100)
 2) Larutan I : Kloroform
 3) Larutan II : Larutan natrium hidroksida cair 0,1 N
 Prinsip
Cuplikan bereaksi dengan asetaldehid/vanilin dalam
suasana asam sehingga terjadi perubahan warna
yang larut dalam kloroform.
 Reagen
 1) Larutan I: Lima tetes asetaldehida dan 0,4 g vanilin
dilarutkan dalam 20 mL etanol 95 %
 2) Larutan II : Asam Hidroklorida pekat
 3) Larutan III : Kloroform

 Tes Duquenois-Levine menggambarkan penentuan

resin ganja dengan membentuk produk berwarna
ungu, yang dapat diekstraksi dengan kloroform
 a. Prinsip
 Pembentukan senyawa berwarna violet
dengan Natrium Nitrit dan asam sulfamat
dalam sua

 Pereaksi
◦ 1) Asam Sulfat 10%
◦ 2) Natrium Nitrit 0,1% (harus dibuat baru)
◦ 3) Asam Sulfamat 0,5%
◦ 4) N-1 Naphtylendiamine dihydrochloride 0,1%
suasana asam
 a. Prinsip
 Parasetamol setelah diekstraksi dengan eter pada pH
3-4 (HCl 2 N) bereaksi dengan NaNO2 dalam suasana
H2SO4 pekat membentuk senyawa berwarna ungu.
Sampel yang diperiksa setelah diekstraksi dengan
eter pada pH 3-4 (HCl 2 N), bereaksi dengan NaNO2
dalam suasana H2SO4 pekat membentuk senyawa
berwarna. Tes dilakukan untuk memberi warna jelas
pada fenol.

 c. Reagen
 1) HCl 2N
 2) Eter
 3) Pereaksi Liebermann (1 gram NaNO2 dalam 10 ml
H2SO4 pekat
 a. Prinsip
 Parasetamol diasamkan dengan HCl 10%,
bereaksi dengan NaNO2 dalam suasana
alkalis dengan penambahan alpha napthol
membentuk senyawa berwarna merah

 c. Reagen
◦ 1) HCl 10%
◦ 2) Natrium Nitrit 1%
◦ 3) Pereaksi Alpha napthol (Alphanapthol 1% dalam
NaOH 10%)
 Prinsip
 Parasetamol dan metabolitnya dihidrolisa
dalam suasana asam menjadi para-
Aminophenol, dengan asam cresol
membentuk senyawa berwarna biru terang

 Reagen
 Pereaksi o-Cressol
 Jenuhkan pereaksi o-Cressol
 Kocok 10 ml o-Cressol dengan 1 aquadest,
biarkan selama 24 jam sebelum digunakan
 Prinsip
 Pembentukan senyawa berwarna ungu antara
FeCl3 dengan Asam Salisilat
 Prinsip
 Terbentuknya senyawa berwarna ungu antara
asam salisilat dan merkuri khlorida dalam
suasana asam
 Reagen
 1) Pereaksi Trinder
 40 gram Merkuri Klorida dilarutkan dalam
850ml asam hidroklorida 0,1 M (1mol/L) dan
40 mg feri nitrat trihidrat, diencerkan sampai
1l dengan aquadest
 a. Prinsip
 Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi
antara etanol dalam spesimen urin dengan
kalium bikromat dalam suasana asam.
 Prinsip
 Di dalam tempat yang kedap, alkohol dalam
spesimen urin akan menguap dan bereaksi
dengan kalium bikromat dalam suasana asam
sehingga terjadi perubahan warna.
 Reagen:
 Kalium bikromat: 0,5 g Kalium bikromat
dalam 100 ml asam sulfat 60%
 Prinsip
 Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi antara
etanol dengan kalium bikromat dalam suasana
asam.
 Reagen
 1) Larutan kalium bikromat (K2Cr2O7) 2,5 %
dalam asam sulfat (H2SO4) 50 %
 2) Asam kromotropat
 3) Etanol

 Warna ungu pada lapisan pemisah menunjukkan

adanya metanol.
 Catatan : formaldehid akan memberikan reaksi
positif pada uji ini.
 Reagen terdiri dari larutan Cobalt thiocyanate dalam
air dan larutan stannous chloride dalam air.
Merupakan uji lapangan yang digunakan untuk
mengidentifikasi kokain (crack) pada sampel
dijalanan.
 Uji ini didasarkan pada kompleksasi larutan alkaloid
dengan larutan kobalt (II) tiosianat (Co(SCN)2(H2O)4)
yang menghasilkan warna biru akibat perubahan dari
Cobalt oktahedral (II) (pink merah ) menjadi Co
(II)tetrahedral (biru).
 Reaksinya sebagai berikut:
 [Co (SCN) (H2O) 5] + (aq) + 3 SCN- (aq) + 2 R3NH +
↔ (R3NH) 2 [Co (SCN) 4] + 5 H2O (l)

 dimana [R3NH] + mewakili ion kokain terprotonasi

 Penggunaan KLT dapat berupa analisis kualitatif
dan analisis kuantitatif. Pada analisis kualitatif,
KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi
senyawa baku.
 Parameter pada KLT yang digunakan untuk
identifikasi adalah nilai Rf.
 Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai
nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT
yang sama. Untuk meyakinkan identifikasi dapat
dilakukan dengan menggunakan lebih dari 1 fase
gerak dan jenis pereaksi semprot.
 Pertama, bercak pada plat KLT diukur
langsung pada lempeng dengan
menggunakan ukuran luas atau dengan
teknik densitometri.

 Kedua adalah dengan mengerok bercak lalu

menetapkan kadar senyawa yang terdapat
dalam bercak tersebut dengan metode
analisis yang lain, misalkan dengan metode
spektrofotometri.
 Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah
dipisahkan dengan KLT biasanya dilakukan
dengan densitometer langsung pada lempeng
KLT (atau secara in situ).

 Densitometer dapat bekerja secara serapan atau

flouresensi, dimana kebanyakan densitometer
mempunyai sumber cahaya yang diarahkan
menuju monokromator (untuk memilih rentang
panjang gelombang yang cocok antara 200-800),
sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng,
pengganda foton, dan rekorder.
 POCT

Penggunaan sistem POCT dapat dilakukan untuk

membantu diagnosis penyakit, pemantauan terapi,
atau mendeteksi racun.
Namun, dalam konteks toksikologi analitis, istilah
ini umumnya diterapkan pada skrining obat-obatan
terlarang.
Pengujian penyalahgunaan obat terlarang biasanya
dilakukan dengan urin, dengan menggunakan
sistem poct berdasarkan immunoassays
(immunoassays lateral flow = ILF).
Prinsip ILF didasarkan pada 2 pendekatan utama
yaitu pengujian langsung (sandwich) dan format uji
kompetitif.
 Sampel pengujian POCT dapat berupa:
 1. Urin
 2. Udara ekspirasi
 3. Saliva atau oral fluid
 4. Keringat

 kit POCT yang dirancang untuk digunakan

dengan sampel cairan oral mungkin perlu
menargetkan analit yang berbeda daripada yang
digunakan saat menguji urin dan pastinya target
konsentrasi akan lebih rendah.
 Keuntungan dari cairan oral untuk pengujian di
lapangan adalah bahwa hasilnya berhubungan
langsung dengan konsentrasi obat dalam darah,
dibandingkan dengan adanya obat dalam urin.
 Ada dua metode pengumpulan dan pengujian
keringat.
 1. Drugwipe, yang bisa juga digunakan untuk
air liur.
 2. 'plester lengket' tamper-proof yang bisa
digunakan untuk mengumpulkan keringat
selama beberapa hari dan umumnya
digunakan di klinik.

 Ada konsistensi yang baik antara hasil untuk

metadon, morfin dan opiat, tapi tidak untuk
benzoylecgonine, dalam keringat yang
dikumpulkan di tempat yang berbeda.
 Dasar metode spektrofotometri UV-visible adalah
cahaya UV dan cahaya tampak mengeksitasi
elektron dari keadaan dasarnya ke keadaan
energi tinggi (terekstitasi). Hukum yang
mengatur hubungan antara intensitas cahaya
yang masuk dan meninggalkan sel adalah Hukum
Beer-Lambert. Ini menyatakan bahwa, untuk
larutan pelarut yang menyerap dalam pelarut
transparan, fraksi cahaya yang diserap sebanding
dengan jumlah molekul zat terlarut di lintasan
cahaya (Hukum Beer) dan panjang lintasan
(Hukum Lambert).
 Kromatografi gas digunakan untuk senyawa yang memiliki
volatilitas yang berada dalam fase gas pada 400°C, dan
tidak terurai pada suhu tinggi.
 Prinsipnya adalah bila campuran zat disuntikkan pada
injektor, masing-masing komponen partisi antara fase
diam dan fasa gas akan dibawa ke arah detektor.
 Molekul yang memiliki afinitas lebih besar pada fase diam
lebih lama tinggal di fase itu dan akibatnya butuh waktu
lebih lama untuk mencapai detektor (RT lebih lama).
 Detektor menghasilkan sinyal yang sebanding dengan
jumlah zat yang melewatinya, dan sinyal ini diproses dan
dimasukkan ke integrator atau perangkat perekam lainnya.
 Setiap substansi yang mengelusi dari kolom memiliki
waktu retensi (retension time=RT) karakteristik, yang
didefinisikan sebagai interval waktu dari respon injeksi ke
puncak detektor
 Sebelum dilakukan kromatografi, diperlukan isolasi senyawa
target dari matriks biologis (plasma, urin, isi perut, rambut dan
jaringan) atau matriks lainnya, seperti tanah, udara atau air.
Penghilangan bahan asing dan pemekatan senyawa target
biasanya terjadi secara bersamaan. Kelarutan air yang tinggi dari
beberapa metabolit obat (misalnya konjugat glucuronide)
memerlukan konversi kimiawi menjadi senyawa yang kurang
polar untuk memungkinkan isolasi dari sampel berbasis air, dan
prosedur hidrolisis sering digunakan untuk tujuan ini.
 Pengendapan protein
Penambahan larutan merkuri klorida atau barium sulfat mudah
mengendapkan protein plasma, dan sentrifugasi memberi
supernatan untuk injeksi langsung ke kolom kromatografi.

Agen pengendapan organik lainnya adalah metanol, aseton dan

asetonitril, yang semuanya harus ditambahkan dalam proporsi
dua jilid pada setiap volume darah.
 a. Jaringan dan rambut
 Jaringan dan rambut memerlukan treatment sebelum
ekstraksi obat untuk memecah matriks biologis. Untuk
jaringan padat, hasil yang baik diperoleh dengan
menginkubasi sebagian jaringan dengan campuran
kolagenase, protease dan lipase dalam buffer pH yang
sesuai.
 Untuk sejumlah kecil jaringan (100 mg), perendaman
semalam pada suhu kamar, agitasi ringan atau
sesekali pencampuran mempercepat prosesnya. Untuk
analisis rambut, pencucian awal untuk menghilangkan
residu dari produk kosmetik atau kontaminan
lingkungan direkomendasikan, dilanjutkan dengan
inkubasi dengan alkali kaustik (untuk obat-obatan
basa) atau asam mineral (untuk obat asam).
 b. Analisis Sianida dan CO
 Kromatografi gas memiliki kelebihan
dibandingkan metode spektrofotometri untuk
analisis karbon monoksida, terutama jika
darah dan jaringan postmortem yang terurai
parah harus dianalisis.
 Metode GC-FID paling awal untuk pengukuran etanol
darah melibatkan pengenceran sampel secara
sederhana (seluruh darah, plasma atau urin) (50 mL)
dengan larutan standar internal (0,16 g propanol/L
dalam air, 500 mL) diikuti pencampuran dengan
vortex (10 detik) dan injeksi langsung campuran hasil
ke dalam kolom yang dikemas dengan saringan
molekuler seperti Chromosorb 102. Senyawa volatil
lain seperti metanol, 2-propanol dan aseton, telah
diatasi dan dapat diukur jika diperlukan. Bahan
karbon hitam yang dimodifikasi juga dapat
digunakan.

 Antikoagulan (lithium heparin atau EDTA) harus

digunakan, seperti pada metode lain dimana seluruh
darah harus diuji
 Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau
lazim disebut HPLC (high performance liquid
chromatography) sesuai untuk analisis
senyawa hidrofilik, termolabil dan atau bobot
molekul (massa relative=MR) tinggi.
 Sistem pada KCKT ada empat tipe mekanisme
yaitu: adsorpsi, partisi, pertukaran ion dan
eksklusi ukuran Kuantitasi dengan metode ini
dapat dilakukan dengan metode standar
ekskternal, standar internal dan penambahan
standar internal pada sampel (spike).
 Secara umum, antikonvulsan, benzodiazepin,
kafein dan xanthine lainnya dan analit yang
polar seperti katekolamin, obat asam, netral
atau lemah, dianalisis pada sistem fase balik.
Dalam kasus xanthine, dianjurkan
penambahan THF ke eluen untuk memastikan
pemisahan metabolit paraxanthine dan
teofilin.
 Metode kurva
kalibrasi

Metode perbandingan standar

 1. Jelaskan tujuan tes screening pada pemeriksaan
obat-obat terlarang!
 2. Jelaskan kelebihan dan kekurangan pemeriksaan
narkotika dan psikotropika dengan metode test
warna!
 3. Sebutkan macam-macam test warna beserta zat
yang dapat diidentifikasi?

 4. Jelaskan prinsip metode berikut:

a. Laminar flow chromatography
b. Spektrofotometri
c. Kromatografi gas
d. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi