PROSEDUR ANALISIS TOKSIKOLOGI

Metode Analisis Toksikologi

Konvensional

Kelompok 4

YOGI PERMANA
RESSA JULIYAWAN
Metode Analisis Toksikologi Konvensional
1. TES WARNA (COLOUR TEST)
Tes warna (kadang-kadang disebut tes kimia) digunakan oleh ahli toksikologi dan
analis obat-obatan sebagai salah satu cara pertama untuk identifikasi obat-obatan dan
racun. Tes warna ini paling banyak digunakan untuk obat-obatan dan residu, serta cairan
biologis seperti isi perut, dan urin.

Metode pemeriksaan pendahuluan dengan reaksi warna Golongan Narkotika :

a. Metode Marquis
b. Metode Bratton Marshall
c. Metode Mecke
d. Metode Frohde
e. Metode Simon
f. Metode Fast Blue B
g. Tes Duquenois
Golongan Psikotropika dan obat lain :
a. Metoda Liebermann
b. Metode Alphanaftol
c. Metode O-Cressol

Golongan Salisilat :
a. Metode Feri Chlorida
b. Metode Trinder Alkohol

Untuk pemeriksaan alkohol :

a. Kalium bikromat
b. Mikrodifusi
c. Metanol
 GOLONGAN NARKOTIKA
Metode Marquis

Prinsip : Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan formaldehid
dalam suasana asam sulfat pekat

Reagen :
• Pereaksi Marquis (Formaldehid 34-38% dan asam sulfat pekat 1:9 v/v)
• Eter Natrium hidroksida (NaOH) 4N
• Etanol 95%

Cara Kerja :
1. Masukkan 2 ml urin kedalam tabung sentrifus
2. Tambahkan NaOH 4N sampai pH 9-10
3. Ekstraksi dengan 5 ml eter, masukkan dalam vortex mixer dan di sentrifus
4. Ekstrak eter dipisahkan dan diuapkan sampai kering
5. Residu dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% (secukupnya), keringkan lagi
6. Tambahkan 1 tetes larutan pereaksi
 Metode Mecke

Prinsip : Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan

asam selenius dalam suasana asam sulfat pekat
Reagen :
• Pereaksi Mecke: 0,25 gram asam selenium larutkan dalam 25 mL asam
sulfat pekat panas
• Eter (untuk urin)
• Natrium hidroksida (NaOH) 4 N (untuk urin)
• Etanol 95 % (untuk urin)

Cara kerja :
1. Masukkan 2 ml urin kedalam tabung sentrifus
2. Tambahkan NaOH 4N sampai pH 9-10
3. Ekstraksi dengan 5 ml eter, masukkan dalam vortex mixer dan di sentrifus
4. Ekstrak eter dipisahkan dan diuapkan sampai kering
5. Residu dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% (secukupnya), keringkan lagi
6. Tambahkan 1 tetes larutan pereaksi
 Metode Frohde

Prinsip : Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan

asam molibdat/natrium molibdat dalam suasana asam sulfat pekat
Reagen :
• Pereaksi Frohde : 1,0 gram asam molibdat/natrium molibdat larutkan dalam
100 mL asam sulfat pekat panas, larutan akhir harus tak berwarna
•Eter (untuk urin)
•Natrium hidroksida (NaOH) 4 N (untuk urin)
•Etanol 95 % (untuk urin).
Cara Kerja :
1. Tambahkan NaOH 4N sampai pH 9-10
2. Ekstraksi dengan 5 ml eter, masukkan dalam vortex mixer dan di sentrifus
3. Ekstrak eter dipisahkan dan diuapkan sampai kering
4. Residu dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% (secukupnya), keringkan lagi
5. Tambahkan 1 tetes larutan pereaksi
Pembacaan Hasil
 Metode Simon

Prinsip : Pembentukan senyawa berwarna antara zat yang diperiksa dengan

reagen Simon dalam suasana basa.
Reagen :
• Pereaksi I = 20 % larutan sodium karbonat dalam akuades,
Pereaksi II = 50 % larutan asetaldehida etanolik,
Pereaksi III = 1 % larutan sodium nitroprusida dalam akuades
• Eter (untuk urin)
• Natrium hidroksida (NaOH) 4 N (untuk urin)
• Etanol 95 % (untuk urin).

Cara Kerja :
1. Untuk pemeriksaan urin lakukan dulu seperti pada metode marquis, langkah 1-5
2. Letakkan sejumlah kecil sampel pada lekukan plat tetes dan campurkan dengan larutan I
satu tetes, lalu tambahkan 2 tetes larutan II, kemudian tambahkan beberapa tetes larutan
III memberikan warna biru untuk metamfetamin dan amin sekunder lain. Amfetamin dan
amin primer lain memberikan warna merah muda perlahan sampai merah cherry. Tes ini
dapat membedakan amfetamin dan metamfetamin.
Pembacaan Hasil
 Metode Garam Fast Blue B (1)

Prinsip : Sampel diekstraksi dengan petroleum eter, kemudian direaksikan dengan

Garam Fast Blue B membentuk senyawa berwarna
Reagen :
•Reagen padat : Garam Fast Blue B (di-o-anisidinetetrazolium klorida)
Encerkan Garam Fast Blue B dengan natrium sulfat anhydrous (1 :100)
•Larutan I : Petroleum eter
•Larutan II : Larutan cair dari natrium bikarbonat 10 % (w/w)

Cara Kerja :
1. Lipat 2 kertas saring menjadi seperempat, buka sebagian untuk membentuk corong
2. Letakkan sejumlah kecil bubuk tanaman kanabis atau resin atau setetes kecil kanabis cair
pada bagian tengah kertas sebelah atas
3. Tambahkan 2 tetes larutan 1
4. Biarkan cairan sampai menembus kertas sebelah bawah
5. Pisahkan kedua kertas saring
6. Buang kertas bagian atas dan biarkan kertas bagian bawah mengering
7. Tambahkan sejumlah kecil reagen padat pada kertas saring bawah dan tambahkan 2 tetes
larutan pereaksi II
Pembacaan Hasil
Warna noda merah keunguan pada bagian tengah kertas saring
menunjukkan adanya kanabis, warna ini adalah kombinasi bermacam warna
dari berbagai kanabinoid yang berbeda adalah komponen mayor dari kanabis;
 THC=merah
 CBN = ungu
 CBD = oranye  
 Metode Garam Fast Blue B (2)

Prinsip : Sampel diekstraksi dengan kloroform, kemudian direaksikan dengan

Garam Fast Blue B membentuk senyawa berwarna
Reagen :
•Reagen padat : Garam Fast Blue B (di-o-anisidinetetrazolium klorida)
•Encerkan Garam Fast Blue B dengan natrium sulfat anhidrous (2,5 :100)
•Larutan I : Kloroform
•Larutan II : Larutan natrium hidroksida cair 0,1 N

Cara Kerja : Pembacaan

Hasil
1. Letakkan sejumlah kecil zat yang akan diperiksa dalam tabung :
reaksi
2. Tambahkan sedikit sekali reagen padat dan 1 mL larutan I Warna, seperti
3. Kocok tabung selama 1 menit pada metode I,
4. Tambahkan 1 mL larutan II pada lapisan cairan
kloroform bagian
5. Kocok tabung reaksi selama 2 menit
bawah
6. Tegakkan tabung rekasi selama 2 menit menunjukkan hasil
positif. Warna dari
 Tes Duquenois

Prinsip : Cuplikan bereaksi dengan asetaldehid/vanilin dalam suasana asam sehingga

terjadi perubahan warna yang larut dalam kloroform.

Reagen :
• Larutan I: Lima tetes asetaldehida dan 0,4 g vanilin dilarutkan
dalam 20 mL etanol 95 %
• Larutan II : Asam Hidroklorida pekat
• Larutan III : Kloroform

Cara kerja :
1. Masukkan sedikit zat yang akan diperiksa ke dalam tabung Pembacaan Hasil :
reaksi Jika lapisan bagian
2. Kocok dengan 2 mL larutan I selama 1 menit bawah (kloroform)
3. Tambahkan 2 mL larutan II, kocok campuran menjadi berwarna ungu
4. Biarkan selama 10 menit, jika muncul warna, tambahkan 2 violet, menunjukkan
mL larutan III. adanya produk kanabis.
Golongan Psikotropika dan obat lain
1. Metode Bratton Marshall
Prinsip : Pembentukan senyawa berwarna violet dengan Natrium Nitrit dan asam
sulfamat dalam suasana asam
Reagen :
•Asam Sulfat 10%
•Natrium Nitrit 0,1% (harus dibuat baru)
•Asam Sulfamat 0,5%
•N-1 Naphtylendiamine dihydrochloride 0,1%

Cara Kerja
1. Ke dalam tabung reaksi masukkan 4 ml urin
2. Tambahkan 1 tetes H2SO4 10% dan 1 tetes Natrium Nitrit 0,1%
3. Biarkan selama 0,5 menit
4. Tambahkan 1 tetes larutan asam sulfamat 0,5% dan biarkan 0,5 menit
5. Teteskan larutan N-1 Naphtylendiamine dihydrochloride 0,1%

Pembacaan Hasil
Apabila terbentuk warna violet secara perlahan-lahan, diduga specimen mengandung
nitrazepam, sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut (konfirmasi test)
2. Metode Liebermann
Prinsip : Parasetamol setelah diekstraksi dengan eter pada pH 3-4 (HCl 2 N)
bereaksi dengan NaNO2 dalam suasana H2SO4 pekat membentuk senyawa
berwarna ungu. Sampel yang diperiksa setelah diekstraksi dengan eter pada pH 3-4
(HCl 2 N), bereaksi dengan NaNO2 dalam suasana H2SO4 pekat membentuk
senyawa berwarna. Tes dilakukan untuk memberi warna jelas pada fenol.
Reagen
•HCl 2N
•Eter
•Pereaksi Liebermann (1 gram NaNO2 dalam 10 ml H2SO4 pekat)

Cara Kerja
1. Kedalam tabung reaksi dimasukkan urin sebanyak 2 ml kemudian ditambahkan
HCl 2 N sampai pH 3-4
2. Ekstraksi dengan 5 ml eter selama 15 menit
3. Keringkan ekstrak di waterbath
4. Residu yang didapat ditambahkan 1 tetes pereaksi Liebermann
3. Metode Alpha naftol
Prinsip : Parasetamol diasamkan dengan HCl 10%, bereaksi dengan NaNO2
dalam suasana alkalis dengan penambahan alpha napthol membentuk
senyawa berwarna merah

Reagen
•HCl 10%
•Natrium Nitrit 1%
•Pereaksi Alpha napthol (Alphanapthol 1% dalam NaOH 10%)

Cara Kerja
1. Kedalam tabung reaksi dimasukkan urin sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan HCl
10% dinginkan
2. Tambahkan 2-3 tetes larutan Natrium Nitrit 1%
3. Tambahkan 2-3 tetes Alphanapthol 1% dalam NaOH 10% (dibuat baru)

Pembacaan Hasil
Apabila terbentuk warna violet secara perlahan-lahan, diduga specimen mengandung
nitrazepam, sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut (konfirmasi test )
4. Metode O-Cressol

Prinsip : Parasetamol dan metabolitnya dihidrolisa dalam suasana asam menjadi

para-Aminophenol, dengan asam cresol membentuk senyawa berwarna
biru terang
Reagen :
•Pereaksi o-Cressol
•Ammonium Hidroksida 2 mol/l (2M)
•HCl 36%
•Standar urin : Pergunakan urin specimen pasien
yang telah mengkonsumsi Parasetamol 1 gram
dalam waktu 24 jam

Cara Kerja :
1. Pipet 0,5 ml specimen (test urin, standar urin dan aquadest
sebagai blanko) masing-masing tambahkan 0,5 ml HCL Pembacaan Hasil :
36% kemudian panaskan diatas waterbath selama 10 menit Apabila terbentuk
pada suhu 100oC warna biru, diduga
specimen mengandung
2. Ke dalam campuran diatas tambahkan 10 ml air, 1 ml O-
Parasetamol, sehingga
Cressol 1% dalam air dan 4 ml Ammonium Hidroksida 2 perlu pemeriksaan lebih
mol/l (2M) lanjut (konfirmasi test)
3. Perhatikan warna yang terbentuk
Golongan Salisilat

1. Metode Feri Chlorida

Prinsip : Pembentukan senyawa berwarna ungu antara FeCl3 dengan Asam Salisilat

Reagen : Larutan FeCl3

Cara Kerja
1. Spesimen Urin : Pipet 2 ml urin dan tambahkan 3 tetes larutan FeCl3 5%
2. Spesimen cairan lambung :
3. Panaskan sampai mendidih selama 10 menit beberapa bagian specimen dengan HCl
0,1N dalam jumlah volume yang sama, bila perlu saring dengan kertas saring
4. Tambah NaOH 0,1N sampai netral
5. Kemudian tambahkan 3 tetes FeCl3 5%

Pembacaan Hasil
Apabila terbentuk warna ungu, diduga specimen mengandung Salisilat,
sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut (konfirmasi test)

2. Metode Trinder Alkohol
Prinsip : Terbentuknya senyawa berwarna ungu antara asam salisilat dan merkuri khlorida dalam
suasana asam
Reagen :
Pereaksi Trinder
40 gram Merkuri Klorida dilarutkan dalam 850ml asam hidroklorida 0,1 M (1mol/L) dan 40 mg feri
nitrat trihidrat, diencerkan sampai 1l dengan aquadest
Asam Hidroklorida 0,1M
Natrium Hidroksida 0,1M

Cara Kerja
Spesimen Urin
Masukkan 1 ml urin pH (5-6) ke dalam tabung reaksi, kemudian tambahkan 5 tetes reagen Trinder,
kocok
Spesimen darah
Masukkan 0,5 ml plasma kedalam tabung reaksi, kemudian tambahkan 4,5 ml pereaksi Trinder, kocok
kemudian sentrifus
 Spesimen cairan lambung
Untuk specimen yang berupa cairan lambung perlu
dilakukan persiapan specimen dengan cara sebagai berikut;
1. Masukkan 2 ml cairan lambung ke dalam tabung reaksi
tambahkan 2 ml HCl 0,1M, didihkan selama 10 menit, dinginkan,
kemudian saring jika perlu, netralkan filtrate dengan
menambahkan larutan NaOH 0,1M
2. Kedalam filtrat cairan lambung tambahkan 3 tetes pereaksi
trinder, campur selama 5 detik

Pembacaan Hasil
Apabila terbentuk warna ungu, diduga specimen mengandung
Salisilat, sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut (konfirmasi test)
Untuk Pemeriksaan Alkohol
1. Kalium Bikromat
Prinsip : Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi antara etanol dalam spesimen urin
dengan kalium bikromat dalam suasana asam.
Reagen
 Larutan kalium bikromat (K2Cr2O7) 2,5 %
 Asam sulfat (H2SO4) 50 %

Cara Kerja
1. Masukkan 5 mL spesimen urin dalam tabung reaksi, lalu tutup
2. Pada kertas saring teteskan K2Cr2O7 tambahkan H2SO4
3. Masukkan kertas saring tersebut dibagian atas leher tabung
4. Sumbat mulut tabung dengan gabus dan panaskan pada penangas air suhu 100° C
selama 2 menit

Interpretasi Hasil
Perubahan warna dari kuning menjadi hijau menandakan alkohol positif.
Etanol memberikan reaksi positif bila kadarnya lebih dari 40 mg %.
2. Mikrodifusi
Prinsip : Di dalam tempat yang kedap, alkohol dalam spesimen urin akan
menguap dan bereaksi dengan kalium bikromat dalam suasana asam
sehingga terjadi perubahan warna.
Reagen: Kalium bikromat: 0,5 g Kalium bikromat dalam 100 ml asam sulfat
60%.
Cara Kerja :
1. Tempatkan spesimen di bagian tepi cawan sampai tertutup dasarnya
2. Tambahkan beberapa ml kalium bikromat di sekitar tempat spesimen
tersebut.
3. Tutup rapat cawan tersebut dan inkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam
Interpretasi Hasil :
Warna kalium bikromat berubah dari kuning menjadi hijau selanjutnya
biru.
3. Metanol
Prinsip : Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi antara etanol dengan kalium
bikromat dalam suasana asam.
Reagen :
 Larutan kalium bikromat (K2Cr2O7) 2,5 % dalam asam sulfat (H2SO4) 50 %
 Asam kromotropat
 Etanol
Cara Kerja :
1. Ke dalam 1 ml urin, tambahkan 1 tetes K2Cr2O7 2,5 % dalam (H2SO4) 50 %

2. Biarkan pada suhu kamar selama 5 menit

3. Tambahkan 1 tetes etanol dan beberapa mg asam kromotropat

4. Tambah H2SO4 sehingga timbul suatu lapisan pada dasar tabung

Interpretasi hasil
Warna ungu pada lapisan pemisah menunjukkan adanya metanol.
Pereaksi Pereaksi Reagen Cobalt
Mayer Marquist Tiosianat, uji Scott

Reagen Dille- Reagen Ehrlich

Koppanyi Reagen
Mandelin

Reagen Mecke
Reagen Fast Blue
Modifikasi
Duquenoi B Salt)
s-Levine Reagen
2. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis (KLT) atau thin layer
chromatography (TLC) adalah teknik yang
banyak digunakan untuk pemisahan dan
identifikasi obat.

Kromatografi dibagi menjadi 3 fase :

1. Fase diam (stationary phase)
Silika gel adalah fase diam yang paling
penting untuk KLT, dengan adsorben oksida
anorganik lainnya, seperti alumina, kieselguhr
(silika gel dengan luas permukaan rendah) dan
Florisil (magnesium silikat sintetik).
2. Fase gerak (mobile phase)
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka tetapi lebih sering
dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.
Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena
daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian
rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.

• Aplikasi (Penotolan)
Obat diteteskan ke plate KLT sebagai titik atau pita dengan ukuran
minimum dengan distribusi bahan homogen di dalam zona awal. Jika
pemindaian densitometri digunakan untuk deteksi, contoh aplikasi manual
dengan perangkat genggam tidak memadai. Untuk densitometri, posisi
awal setiap titik harus diketahui secara akurat, yang dicapai dengan
mudah dengan alat mekanis yang beroperasi pada mekanisme grid yang
tepat. Sampel juga harus diterapkan pada lapisan tanpa mengganggu
permukaan, sesuatu yang hampir tidak mungkin dicapai dengan
menggunakan aplikasi manual.
Penggunaan KLT dapat berupa analisis kualitatif dan analisis
kuantitatif :
 Pada analisis kualitatif, KLT dapat digunakan untuk uji
identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang
digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa
dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika
diukur pada kondisi KLT yang sama.
 Pada analisis kuantitatif pada KLT dapat digunakan dua
cara. Pertama, bercak pada plat KLT diukur langsung pada
lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan
teknik densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok
bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat
dalam bercak tersebut dengan metode analisis yang lain,
misalkan dengan metode spektrofotometri.
Bagan Kerja Kromatografi Lapis Tipis