PROSEDUR

ANALISIS
TOKSIKOLOGI
-indah sari-
METODE
ANALISIS
KONVENSIONAL
 Tes warna ini paling banyak digunakan untuk obat-obatan
dan residu, serta cairan biologis seperti isi perut, dan urin.
 Tes ini digunakan untuk menempatkan senyawa yang tidak
diketahui ke dalam kelas senyawa tertentu.
 Tes warna ini tetap populer karena berbagai alasan, mudah
dilakukan, penggunaan reagen minimal, murah dan memberi
hasil yang bisa dilihat dengan mata telanjang (tidak
memerlukan alat khusus). TES WARNA
 Pemeriksaan screening hanya untuk mengarahkan
kemungkinan jenis zat yang terdapat dalam sampel, sehingga
(COLOUR
hasilnya harus dilanjutkan dengan tes konfirmasi karena zat TEST)
selain narkoba juga mempunyai kemungkinan memberikan
hasil yang sama (false positive).
 1. Sangat cepat dan murah, hanya menambahkan reagen
kemudian amati warna yang terbentuk
 2. Terutama berguna untuk urine atau cairan lambung atau
“residu kejadian”, misalnya tablet atau serbuk
 3. Biasanya dilakukan dengan tabung reaksi bening, tetapi
plat tetes putih lebih baik (latar belakang seragam, sedikit
menggunakan reagen). KELEBIHAN
 4. Harus selalu menganalisa banko reagen dan kontrol positif DAN
dengan sampel
KEKURANGAN
 5. Bersifat subjektif, orang berbeda dalam cara mereka
memandang atau mendeskripsikan warna, warna juga
TES WARNA
bervariasi intensitasnya
 6. Banyak jenis tes yang tersedia, namun sebagian besar
memiliki selektivitas yang buruk
METODE
PEMERIKSAAN
PENDAHULUAN
DENGAN REAKSI
WARNA
 Metode Marquis Metode Mecke
Prinsip: Pembentukan senyawa Prinsip: Pembentukan senyawa
berwarna antara zat yang diperiksa berwarna antara zat yang diperiksa
dengan formaldehid dalam suasana dengan asam selenius dalam
asam sulfat pekat suasana asam sulfat pekat METODE
PEMERIKSAAN
PENDAHULUAN
Metode Frohde
DENGAN REAKSI
Prinsip: Pembentukan senyawa
WARNA
berwarna antara zat yang diperiksa
dengan asam molibdat/natrium
molibdat dalam suasana asam
sulfat pekat
HASIL TES WARNA
METODE
MARQUIS, MECKE
DAN FROHDE
HASIL TES
WARNA
REAGEN
FROHDE
 METODE SIMON
PRINSIP:
PEMBENTUKAN
SENYAWA
BERWARNA
ANTARA ZAT YANG
DIPERIKSA
DENGAN REAGEN
SIMON DALAM
SUASANA BASA
 Metode Garam Fast Blue B (1)
Prinsip: Sampel diekstraksi dengan petroleum eter,
kemudian direaksikan dengan Garam Fast Blue B
membentuk senyawa berwarna
Pembacaan hasil: Warna noda merah keunguan pada
bagian tengah kertas saring menunjukkan adanya
kanabis
Metode Garam Fast Blue B (2)
Prinsip: Sampel diekstraksi dengan kloroform,
kemudian direaksikan dengan Garam Fast Blue B
membentuk senyawa berwarna
Pembacaan hasil: Warna, seperti pada metode I,
pada lapisan cairan kloroform bagian bawah
menunjukkan hasil positif

Tes Duquenois
Metode Bratton Marshall METODE
Prinsip: Cuplikan bereaksi dengan asetaldehid/vanilin
dalam suasana asam sehingga terjadi perubahan
Prinsip: Pembentukan senyawa berwarna violet
dengan Natrium Nitrit dan asam sulfamat dalam PEMERIKSAAN
suasana asam
warna yang larut dalam kloroform.
Pembacaan hasil: Jika lapisan bagian bawah
Pembacaan hasil: Apabila terbentuk warna violet PENDAHULUAN
(kloroform) menjadi berwarna ungu violet,
menunjukkan adanya produk kanabis
secara perlahan-lahan, diduga specimen mengandung
nitrazepam, sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut DENGAN REAKSI
(konfirmasi test)
WARNA

Metode Liebermann
Prinsip: Parasetamol setelah diekstraksi dengan eter
pada pH 3-4 (HCl 2 N) bereaksi dengan NaNO2
dalam suasana H2SO4 pekat membentuk senyawa
berwarna ungu. Sampel yang diperiksa setelah
diekstraksi dengan eter pada pH 3-4 (HCl 2 N),
bereaksi dengan NaNO2 dalam suasana H2SO4 pekat
membentuk senyawa berwarna. Tes dilakukan
untuk memberi warna jelas pada fenol.
PEMBACAAN HASIL
METODE
LIEBERMANN
 Metode Alpha naftol
Metode O-Cressol
Prinsip: Parasetamol diasamkan dengan HCl 10%,
Prinsip: Parasetamol dan metabolitnya dihidrolisa
bereaksi dengan NaNO2 dalam suasana alkalis
dalam suasana asam menjadi paraAminophenol,
dengan penambahan alpha napthol membentuk
dengan asam cresol membentuk senyawa berwarna
senyawa berwarna merah
biru terang
Pembacaan hasil: Apabila terbentuk warna violet
Pembacaan hasil: Apabila terbentuk warna biru,
secara perlahan-lahan, diduga specimen mengandung
diduga specimen mengandung Parasetamol, sehingga
nitrazepam, sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut
(konfirmasi test)
perlu pemeriksaan lebih lanjut (konfirmasi test) METODE
PEMERIKSAAN
PENDAHULUAN
DENGAN REAKSI
WARNA
 Metode Trinder
Metode Feri Chlorida
Prinsip: Terbentuknya senyawa berwarna
Prinsip: Pembentukan senyawa berwarna
ungu antara asam salisilat dan merkuri
ungu antara FeCl3 dengan Asam Salisilat
khlorida dalam suasana asam
Pembacaan Hasil: Apabila terbentuk warna
Pembacaan Hasil: Apabila terbentuk warna
ungu, diduga specimen mengandung Salisilat,
ungu, diduga specimen mengandung Salisilat,
sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut
(konfirmasi test)
sehingga perlu pemeriksaan lebih lanjut METODE
(konfirmasi test)
PEMERIKSAAN
PENDAHULUAN
DENGAN REAKSI
WARNA
 Kalium Bikromat
Prinsip: Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi Mikrodifusi
antara etanol dalam spesimen urin dengan kalium Prinsip: Di dalam tempat yang kedap, alkohol dalam
bikromat dalam suasana asam. spesimen urin akan menguap dan bereaksi dengan
kalium bikromat dalam suasana asam sehingga terjadi
Interpretasi Hasil: perubahan warna.
1) Perubahan warna dari kuning menjadi hijau Interpretasi Hasil: Warna kalium bikromat berubah
menandakan alkohol positif. 2) Etanol memberikan
reaksi positif bila kadarnya lebih dari 40 mg %.
dari kuning menjadi hijau selanjutnya biru.
METODE
PEMERIKSAAN
PENDAHULUAN
DENGAN REAKSI
Metanol WARNA
Prinsip: Terbentuknya warna hijau hasil oksidasi
antara etanol dengan kalium bikromat dalam
suasana asam.
Interpretasi hasil: Warna ungu pada lapisan pemisah
menunjukkan adanya metanol. Catatan : formaldehid
akan memberikan reaksi positif pada uji ini.
 Kromatografi lapis tipis (KLT) atau thin layer chromatography (TLC) adalah
teknik yang banyak digunakan untuk pemisahan dan identifikasi obat.
 Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu contoh kromatografi planar
disamping kromatografi kertas. KROMATOGRAFI
 Fase gerak atau pelarut pengembang akan bergerak naik sepanjang fase diam
LAPIS TIPIS (KLT)
karena adanya gaya kapilaritas pada sistem pengembangan menaik
(ascending). Pemilihan fase gerak baik untuk TLC maupun HPTLC ATAU THIN LAYER
didasarkan pada keterpisahan senyawa-senyawa dalam analit yang CHROMATOGRAPH
didasarkan pada nilai Rf atau hRf (100Rf). Pemisahan senyawa terjadi
berdasarkan kompetisi pengikatan solut dan solven pada fasa diam. Nilai Rf Y (TLC)
diperoleh dari membagi jarak pusat kromatogram dari titik awal dengan
jarak pergerakan pelarut dari titik awal. Penghitungan nilai hRf ditunjukkan
dengan persamaan dibawah ini.

Fase gerak (mobile phase)

Fase diam (stationary phase)
Silika gel adalah fase diam yang
paling penting untuk KLT, dengan
adsorben oksida anorganik lainnya,
seperti alumina, kieselguhr (silika
gel dengan luas permukaan rendah)
dan Florisil (magnesium silikat
sintetik).
Fase gerak harus mempunyai
kemurnian yang sangat tinggi karena
KLT merupakan teknik sensitif;
daya elusi harus diatur sedemikian
rupa sehingga harga Rf terletak
antara 0,2 – 0,8; polaritas fase gerak
dapat mempengaruhi kecepatan
migrasi solut dan penentuan harga
Rf; untuk campuran ionik dan polar
lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya
dengan perbandingan tertentu.
Aplikasi (Penotolan)
Obat diteteskan ke plate KLT
sebagai titik atau pita dengan ukuran
minimum dengan distribusi bahan
homogen di dalam zona awal. Untuk
lapisan berkinerja tinggi, dengan
diameter titik awal yang diinginkan
sekitar 1,0 sampai 2,0 mm, ini sesuai
dengan volume sampel 100 sampai
200 nL jika diaplikasikan dengan
dosimeter (mikropipet).
METODE
ANALISIS
TOKSIKOLOGI
MODERN
 Laboratory Medicine Practice Guideline (National Academy
Clinical Biochemistry) mendefinisikan POCT sebagai
pengujian laboratorium klinis yang dilakukan di dekat lokasi POINT OF
perawatan pasien, biasanya oleh petugas klinis yang
ketrampilan utamanya tidak dalam ilmu laboratorium klinis
CARE TEST
atau bisa dilakukan oleh pasien (self-testing). (POCT)
 POCT dapat dianggap sebagai pengujian yang dilakukan di
luar laboratorium tradisional dan dapat juga disebut sebagai
uji laboratorium pengawasan perawatan di tempat, pengujian
di samping tempat tidur, pengujian dekat-pasien (Near Patient
Test=NPT), pengujian di rumah dan perawatan diri sendiri.
 POCT dalam toksikologi lebih ditujukan untuk pengujian
terhadap obat yang disalahgunakan dan alcohol.
Berdasarkan dasar reaksinya terdapat beberapa jenis, yaitu:

Reaksi Antibody
Obat kromogenik – konjugat
aglutinasi kromogenik

Berdasarkan pengamatan hasil bisa secara:

Visual
Semi POCT
automatik

Berdasarkan bentuknya terdapat bentuk

Strip dan
dip card
Cassette Test-cup Automatic
(kartu
celup)
 Sampel pengujian POCT dapat berupa:

Saliva
Udara
Urin atau oral Keringat
ekspirasi
fluid

POCT
 Perangkat yang lebih baru untuk skrining obat terlarang
didasarkan pada immunoassays aliran lateral (immunoassays
lateral flow=ILF)
 Prinsip ILF didasarkan pada 2 pendekatan utama yaitu format
pengujian langsung (sandwich) dan format uji kompetitif.
 1) Format sandwich: analit ditangkap di antara dua antibodi
komplementer. Salah satu antibodi ini dikonjugasikan ke
reagen deteksi dan ditahan di pad pelepasan konjugasi,
sedangkan antibodi lainnya diimobilisasi pada garis uji pada
TES
membran. IMMUNOASSA
 2) Format kompetitif digunakan untuk analit yang lebih kecil Y
yang memiliki satu determinan antigenik tunggal dan oleh
karena itu tidak dapat mengikat dua antibodi secara
bersamaan.
Hukum Beer-Lambert
 Dalam spektrometri UV atau sinar tampak (visible), analit
menyerap beberapa energi cahaya masuk sebagai hasil
elektron dalam molekul yang tereksitasi ke tingkat energi
yang lebih tinggi.
 Beberapa factor penyebab penyimpangan Hukum Beer-
Lambert:

SPEKTROFOTO
METRI
Analit
Interaksi atau
Konsentrasi memisah atau
adanya Instrumental
analit bereaksi
dekomposisi
dengan pelarut
 Prinsip Kromatografi Gas
 Pemisahan dilakukan dalam kolom (mengandung fase
stasioner padat atau cair) yang memiliki aliran fase gerak
terus menerus yang melewatinya (biasanya gas pembawa
inert), namun baru-baru ini cairan superkritis (super critical
fluid=SCFs) telah digunakan untuk beberapa aplikasi],
digunakan dalam oven dengan suhu yang diatur.
 Peralatan: Biasanya sistem GC terdiri dari unit kontrol gas,
yang memasok gas pembawa ke kolom dan juga gas, seperti
udara tekan dan hidrogen, ke detektor, sistem injeksi sampel, KROMATOGR
kolom analisis, dan detektor dengan perolehan data yang
terkait AFI GAS
 a. Dapat diinjeksikan campuran berair untuk beberapa aplikasi seperti
etanol, dan berbagai senyawa volatil.
 b. Rentang kolom kapiler stabil dan efisien
 c. Tersedia detektor Sensitive universal (FID) dan selektif (NPD, ECD,
MS) detektor
 d. Bisa digunakan untuk uji kualitatif dan kuantitatif
 e. Kolom kapiler lebar yang digunakan dengan pelapis injeksi KEUNTUNGAN GC
memudahkan kerja kuantitatif
DALAM
 f. Hubungan antara waktu elusi, suhu kolom, dan bobot molekul berharga
dalam uji kualitatif
TOKSIKOLOGI
 g. Retensi data GC dapat diperoleh kembali pada hari, kolom, instrumen,
ANALITIS
operator yang berbeda
 h. Pemrograman suhu dan interfacing ke MS atau FTIR mudah -
memerlukan beberapa jenis kolom karena daya penyelesaiannya tinggi
terutama dengan GC-MS
 i. Dapat menghasilkan spektrum EI dari GC-MS
 j. Indeks puncak utama berharga dalam identifikasi majemuk
 k. Dapat digunakan untuk berbagai macam gas dan pelarut
 Sebelum dilakukan kromatografi, diperlukan isolasi senyawa
target dari matriks biologis (plasma, urin, isi perut, rambut
dan jaringan) atau matriks lainnya, seperti tanah, udara atau
air. Penghilangan bahan asing dan pemekatan senyawa target
biasanya terjadi secara bersamaan. Kelarutan air yang tinggi
dari beberapa metabolit obat (misalnya konjugat glucuronide)
memerlukan konversi kimiawi menjadi senyawa yang kurang
polar untuk memungkinkan isolasi dari sampel berbasis air,
dan prosedur hidrolisis sering digunakan untuk tujuan ini.
PREPARASI
SAMPEL

Ekstraksi Ekstraksi
Presipitasi Ekstraksi
padat-cair mikro fase
protein cair – cair
atau padat padat
 Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau lazim disebut HPLC
(high performance liquid chromatography) sangat sesuai untuk analisis
senyawa hidrofilik, termolabil dan atau bobot molekul (massa
relative=MR) tinggi.
 Keuntungan HPLC dalam toksikologi analitis:

 a. Pemisahan yang cepat dan efisien, selektivitas dapat dikendalikan

KROMATOGR
dengan memilih eluen AFI CAIR
 b. Analisis molekul polar dengan BM tinggi yang tidak dapat
dilakukan dengan KG
KINERJA
 c. Sensitif, selektif, detektor non-destruktif (UV, fluoresensi) yang bisa TINGGI
digunakan secara seri (KCKT)
 d. Dapat digabungkan dengan MS-ESI, APCI, deteksi yang sangat
selektif untuk analit yang ditargetkan
 e. Dapat diinjeksikan sampel berair (tapi selektivitas berkurang
dibandingkan dengan misalnya ekstrak pelarut)
 f. Peralatan portable, tidak diperlukan gas, oven suhu tinggi, dan
sebagainya
 g. Relatif mudah untuk mengotomatisasi
 Sistem HPLC terdiri dari reservoir eluen, pompa bertekanan
tinggi (atau pompa dengan sistem gradien pencampur
bertekanan tinggi) dengan flow controller, sistem injeksi
sampel, pelindung stainless steel dan kolom analisis yang
dikemas dengan bahan fase stasioner, sebuah detektor, dan
sistem pengambilan data

PERALATAN
HPLC