• Barbiturat adalah obat-obatan yang berperan sebagai penekan system saraf pusat rasa takut, selain itu mereka

dapat memproduksi efek spektrum yang luas, mulai dari penenang ringan hingga rasa terbius secara penuh.
Barbiturat secara theurapic biasa digunakan untuk pembius, penghilang kejang-kejang, penghilang kecemasan,
penghipnotis serta penenang.
• Mereka merupakan obat sintesis terderivasi dari asam barbitur yang merupakan hasil dari kondensasi sintesis
senyawa asam malonic dan urea. Secara umum mereka merupakan pengganti dari pola pada posisi -5 dengan
memasukkan sebuah N-methyl pada N-1

Barbiturates
Sampling

R1

O N O Terdapat lebih dari 2.500 hasil sintesis dari barbiturat dan lebih dari 50 jenis
sintesis yang beredar di pasaran secara klinis. Barbiturat dapat digolongkan
sebagai berikut :
Golongan II : Secobarbital,
Golongan III : Amobarbital, butalbital, siklobarbital, dan pentobarbital,
R4 N
Golongan IV : Allobarbital, barbital, butobarbital, methylpenobarbital,
R2 penobarbital, secbutabarbital, dan vinylbital.
R3

O
 Langkah-langkah Pengujian Sampel
Kualitatif Warna

Identifikasi Uji Praduga TLC

Colour Test

Sampling
Kuantifikasi Screening GC-FID dan MS
Sampling Pengujian Metode

Legalisasi Tes Konfirmasi HPLC

FTIR
 Ekstraksi dan Persiapan Sampel
• Analisis Kualitatif
Digerus tablet atau dibuka kapsul untuk mendapatkan sampel serbuk dan methanol secukupnya untuk mendapatkan
larutan sekitar 1 sampai 20 𝑚𝑔Τ𝑚𝐿 barbiturate. Setelah itu, sampel langsung diektraksi atau difiltrasi dan evaporasi
hinggan mengering dengan uap nitrogen.
Colour Test

Sampling
• Analisis Kuantitatif
Untuk sampel kapsul barbiturate pada wujud bebas asam, digabungkan isi dari sejumlah sampel kapsul yang akan
diuji. Ditimbang secara akurat, lalu dipindahkan sampel ke erlenmeyer dan dilarutkan dengan ethyl acetate. Sampel
langsung di ekstraksi atau dihilangkan aliquot yang terfiltrasi dan terevaporasi hingga kering pada dengan uap
nitrogen. Untuk sampel kapsul barbiturate dalam wujud garam, dilarutkan sejumlah kapsul yang ingin ditentukan,
disesuaikan volume air (kurang lebih 10 mL) pada corong yang terpisah. Ditambahkan beberapa tetes HCl 3N untuk
mengasamkan larutan. Diekstraksi dengan 10 mL ethyl acetate. Dihomogenkan, lalu difilter menggunakan glass wool.
Filtrat langsung diekstraksi atau dihilangkan aliquot dan dievaporasi hingga kering dengan uap nitrogen.
 Dille-Koppanyi Test
Larutan 1 : Dilarutkan 0.1 cobaltous acetat tetrahydrate dalam 100 mL methanol murni, lalu ditambahkan 0.2 mL glacial acetic acid.
Larutan 2 : Dicampurkan 5 mL isopropylamine dengan 95 mL methanol murni.
Metode : Sampel ditetesi larutan 1 dan 2 sebanyak tiga tetes.

Colour Test
Hasil : Sampel berwarna ungu

Sampling
TLC

Koppanyi-Zwikker Test
Larutan 1 : Disiapkan 1% 𝑏Τ𝑣 larutan cobalt nitrate pada ethanol, lalu ditambahkan 10μL pyrrolidine.
Metode : Sampel dilarutkan dalam 1mL ethanol pada cawan petri, lalu ditambahkan satu tetes larutan 1 dan dibiarkan.
Hasil : Sampel berwarna biru-keunguan.
 Fase Diam
• Pelapisan
Dilapisi dengan silica gel G dengan ketebalan 0.25 mm dengan kandungan indicator inert, serta berflurosensi pada
panjang gelombang 254nm sinar UV.
• Ukuran khusus pelat : 20x20 cm; 10x5 cm
Pelat harus diaktivasi terlebih dahulu dengan dipanaskan pada suhu 120°C selama 10 hingga 30 menit. Pelat disimpan
GC-FID-MS

Colour Test
Sampling
pada desikator bebas lemak diatas silica gel biru.

TLC
Fase Gerak
Sistem A : Ethyl acetate, methanol, 25% larutan ammonia (85:10:5 v/v/v)
Sistem B : Chloroform, acetone (8:2 v/v)
Persiapan Larutan
𝑚𝑔
Sampel diekstraksi, lalu disiapkan larutan sampel dengan konsentrasi sekitar 5 Τ𝑚𝐿 yang terlarut di methanol.
Dipindahkan 1 hingga 2μL sampel dan larutan standard ke pelat.
Visualisasi
• Penembakkan cahaya UV pada 254 nm
• Reagen semprot Mercuric chloride-diphenylcarbazone
 Gas Chromatography – Flame Ionization Detector
Intrumen GC yang digunakan, menggunakan kolom internal berdiameter diantara 0.2 dan 0.32 mm serta memiliki system kolom
yang terpaketkan.
Teknik Kolom Kapiler tanpa Derivatisasi
Kondisi Pengoperasian
• Kolom : 25m x 0.35mm dengan ketebalan lensa 0.52μm atau lebih tipis,
• Fase :Gabungan silica yang terikat secara kimiawi dan terikat menyilang dengan methylsilicone atau
0,54 %

GC-FID-MS
Kesimpulan

methylphenylsilicone seperti OV-1, SE-30, SE-54 atau yang setara,

• Pengangkut : Nitrogen atau Helium pada 1mL/menit,

TLC
• Penginjeksi : Terpisah/menyatu, pada 275°C,
• Rasio pembagi : 20:1,
• Oven : Isothermal pada 200°C atau diprogram antara 200-260°C pada 4°C/menit,
• Detektor : FID 275°C, hydrogen 35mL/menit, udara 350 mL/menit,
• Standar Internal : n-alkanes,
• Injeksi : 1μL..
Preparasi Sampel
Disiapkan standar internal, obat standar dan larutan sampel pada konsentrasi 1𝑚𝑔Τ𝑚𝐿. Diinjeksi 1μL sampel dan larutan standar
kedalam instrument.
Hasil
Hasil yang didapat tiap senyawa barbiturate dan derivasinya beragam sesuai dengan indikasi retensinya.
 Gas Chromatography – Mass Spectrometry
Preparasi Larutan Sampel
Metode preparasi sampel menggunakan kolom internal berdiameter diantara 0.2 dan 0.32 mm serta memiliki system kolom
yang terpaketkan.
Kondisi Pengoperasian GC-MS
• Kolom : 30m x 0.25mm dengan ketebalan lensa 0.25 μm,
0,54 %

GC-FID-MS
Kesimpulan

• Fase : Gabungan silica yang terikat secara kimiawi dan terikat menyilang dengan methylsilicone atau
methylphenylsilicone seperti DB-1, OV-1, SE-30, SE-54 atau yang setara,

TLC
• Pengangkut : Helium pada 1mL/menit, pada aliran atau tekanan konstan,
• Penginjeksi : Terpisah/menyatu, 250-300°C seperti yang disesuaikan,
• Oven : Isothermal pada 200°C atau diprogram antara 200-260°C pada 4°C/menit,
• Detektor
• Mode Ionisasi : El mode, 70eV,
• Temperatur perpindahan : 280°C atau disesuaikan,
• Temperatur sumber ion : 230°C atau disesuaikan,
• Parameter pembacaan : TIC (SIM jika diperlukan), rentang pembacaan hingga 500amu
Hasil
Identifikasi dilakukan dengan membandingkan waktu retensi dan spektrum massa dari analit dengan standar pembanding.
 Gas Chromatography – Mass Spectrometry untuk Derivasi Barbiturat Tertentu
Preparasi Larutan Sampel dan Standar Barbiturat
• Larutan Barbiturate Standar
Ditimbang sejumlah kecil standard barbiturate yang telah disesuaikan ke labu ukur untuk mendapatkan konsentrasi akhir
sebesar 0.1 𝑚𝑔Τ𝑚𝐿 pada tiap senyawa, kemudian dilarutkan dengan methanol.
• Larutan Sampel Barbiturate
Ditimbang sejumlah kecil sampel ke labu ukur dengan konsentrasi yang disesuaikan dengan larutan 0,54
standar,%

GC-FID-MS
HPLC-FTIR

kemudian
dilarutkan dengan methanol. Bergantung pada asal mula dari sampel, partikulat padatan tak larut apapun dapat

TLC
dihilangkan dengan filtrasi.
Kondisi Pengoperasian
• Kolom : HP-5MS, ketebalan lensa 0.25μm, kapiler silica yang digabungkan berdiameter 30m x 0.25mm,
• Suhu kolom : 100°C untuk 1 min, lalu 100-280° pada 15°C min-1, lalu dipertahan suhu pada 280°C selama 3 min,
• Suhu injeksi : 250°C,
• Suhu sumber ion : 280°C,
• Mode injeksi : Menyatu
• Fase gerak : Helium pada 50kPa
• Detektor : El mode 70eV, rentang pembacaan 𝑚Τ𝑧 50-500
 High Performance Liquid Chromatography
Preparasi Larutan Sampel dan Standar Barbiturat
• Larutan Barbiturate Standar
Ditimbang sejumlah kecil standard barbiturate yang telah disesuaikan ke labu ukur untuk mendapatkan konsentrasi akhir sebesar 1 𝑚𝑔Τ𝑚𝐿 pada
tiap senyawa, kemudian dilarutkan dengan methanol.
• Larutan Sampel Barbiturate
𝑚𝑔
Ditimbang sejumlah kecil sampel hasil ekstraksi ke labu ukur, kemudian dilarutkan dengan methanol hingga konsentrasi mencapai 1 Τ𝑚𝐿.
Bergantung pada asal mula dari sampel, partikulat padatan tak larut apapun dapat dihilangkan dengan filtrasi.
Metodelogi
0,54 %

GC-FID-MS
HPLC-FTIR
Metode 1 dengan Metode 2 Secara Berurutan

TLC
• Kolom : 250 mm x 4.6 mm ID ; 150 mm x 4.6 mm ID,
• Zat Terpaketkan : Octadecyl-silica bertaraf HPLC, 5μm (Spherisorb 5 ODS-2 atau setara) ; Octadecyl-silica bertaraf HPLC, 5μm
(ODS-Hypersil atau setara),
• Fase Gerak : (Acetonitrile : Air (3:7 (volume)) ; (A) 0.1M sodium dihydrogen phosphate buffer : methanol (6:4 pada pH
3.5 dengan phosphoric acid) - (B) 0.1M sodium dihydrogen phosphate buffer : methanol (6:4 pada pH 8.5
dalam larutan sodium hydroxide),
• Laju Alir : 0.9 𝑚𝐿Τ𝑚𝑖𝑛 ; 2.0 𝑚𝐿Τ𝑚𝑖𝑛,
• Pendeteksian : UV pada 220 nm atau susunan pendeteksi diode (DAD) ; UV pada 216 nm,
• Volume Injeksi : 1-5μL ; 1-5μL dengan suntikan,
• Perhitungan : Menggunakan area puncak dan metode standar eksternal ; menggunakan area puncak dan metode standar
eksternal.
Hasil
Hasil yang didapatkan berbeda-beda tergantung masing-masing senyawa yang terbaca.
 Fourier Transform Infra-Red
Secara teoritis, tiap senyawa pada kingdom barbiturate memiliki spektrum infra merah yang berbeda-beda dan metode ini
dapat mempertegas pengenalan barbiturate dan derivasinya tanpa perlu membedakan kedua enantiomer masing-masing
senyawa.
Untuk sampel serbuk, diutamakan dalam menganalisanya menggunakan kromatografi, dikarenakan pada spectrum infra-
merah akan menggunakan pellet KBr sebagai pembanding spectra dari barbiturate yang bebas dari keasaman serta
garamnya. Pada sampel kapsul, tablet, maupun serbuk yang dicurigai merupakan campuran perlu diberi perlakuan berupa
ekstraksi terlebih dahulu sebelum dianalisa dan digunakan untuk memisahkan barbiturat menjadi bebas dari keasaman.
0,54 %

GC-FID-MS
Kendala-kendala dalam membandingkan spectra infra-merah muncul saat adanya wujud polymorphic pada sebagian

HPLC-FTIR
barbiturate, hal ini tentu dapat memberikan perbedaan dalam spectra infra-merahnya.

TLC
ANY QUESTION ?
THANK YOU
Kelompok 4