Analisis Vitamin

Ada dua cara yang dapat digunakan untuk menganalisis vitamin, yaitu dengan cara
kualitatif dan kuantitatif. Berikut adalah beberapa metode yang dapat digunakan untuk
menganalisis vitamin, meliputi;
Vitamin A (Retinol)
A. Uji Kualitatif
 Uji Identifikasi Vitamin A dengan Pereaksi Carr-Price
Prinsip :
Berdasarkan penambahan kloroform dan asam asetat anhidrid. Selanjutnya dibubuhkan
seujung sendok kristal SbCl3 ke dalamnya sehingga terbentuk warna biru yang akan
berubah menjadi merah coklat berarti positif vitamin A.
Cara Analisis :
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dimasukkan 5 tetes minyak ikan ke dalam tabung reaksi
c. Ditambahkan 10 tetes kloroform, kemudian homogenkan dengan baik
d. Ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrit
e. Selanjutnya, dibubuhkan seujung sendok Kristal Sbcl3 ke dalamnya
f. Perhatikan perubahan warna
g. Jika terbentuk warna biru yang akan berubah menjadi merah coklat berarti vitamin A
positif.

 Uji Identifikasi Vitamin A dengan Pereaksi Trikloroasetat (TCA)

Prinsip :
Berdasarkan penambahan pereaksi asam trikloroasetat dalam kloroform amati warna
yang terjadi bila timbul warna biru kehijauan menandakan positif vitamin A.
Cara Analisis :
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dimasukkan 5 tetes minyak ikan ke dalam tabung reaksi
c. Tambahkan 1 ml pereaksi asam trikloroasetat dalam kloroform
d. Dihomogenkan dengan baik
 e. Amati warna yang terjadi, jika timbul warna biru kehijauan menandakan positif
vitamin A.

B. Uji Kuantitatif
Prinsip :
Vitamin A akan terekstrak ke dalam larutan organik. Semua transretinol dan 13 cisretinol
diukur dengan HPLC dengan kolom silika. HPLC adalah metode yang akurat digunakan
dalam pengukuran vitamin A.

Metode Kromatografi (HPLC) :

 Preparasi Sampel
Dimasukkan sebanyak 40 mL sampel (makanan formula atau susu cair) ke dalam tabung
digesti 100 ml, tambahkan 10 ml etanolik pirogallol (2% pirogallol dalam 95% etanol)
dan sabunkan dengan etanolik KOH (10% KOH dalam 90% etanol) pada suhu ruang
selama 18 jam.

 Ekstraksi
Pipet 3 ml sampel yang telah terdigesti ke dalam tabung sentrifus 15 ml dan tambahkan 2
ml air. Ekstrak dengan 7 ml heksan-dietileter (85:15). Ulangi ekstraksi sebanyak dua kali.
Masukkan sampel terekstrak ke dalam tabung volumetrik 25 ml. Tambahkan 1 ml
heksadekan (heksadekan (1) + hexan (100)) dan diencerkan sampai 25 ml dengan
heksan. Pipet 15 ml ekstrak yang sudah diencerkan ke dalam tabung sentrifus dan uapkan
dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5 ml heptan.

 Parameter Kromatografi :
 Kolom : 15 cm x 4.5 mm dipadati dengan 3 mm silika (Apex mm silika)
 Fase gerak : Isokratik, heptane dan isopropanol (1-5%)
 Deteksi : UV , 340 nm
 Flow rate : 1-2 ml/menit
Perhitungan Kadar
area puncak sampel
×[ standar vit . A ] ×volume akhir (mL )×fp
area puncak standar
Kadar vitamin A=
bobot sampel ( g)
Vitamin D (Kalsiferol)
A. Uji Kualitatif
Prinsip :
Berdasarkan penambahan larutan H2O2 5% dihomogenkan kemudian dipanaskan
lalu didinginkan. Selanjutnya dilakukan uji dengan pereaksi Carr-price. Amati perubahan
warna jika berwanra jingga kuning berarti positif vitamin D.
Cara Analisis :
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dimasukkan masing-masing 10 tetes minyak ikan ke dalam 2 tabung reaksi
c. Ditambahkan 10 tetes larutan H2O2 5%
d. Dikocok campuran kira-kira 1 menit.
e. Dipanaskan di atas api kecil perlahan-lahan sampai tidak ada gelembung-gelembung
gas yang keluar. Usahakan jangan sampai mendidih.
f. Dinginkan tabung dibawah air kran.
g. Dilakukan  uji dengan uji pereaksi Carr-Price
h. Amati perubahan warna yang terjadi. Adanya warna jingga kuning berarti positif
vitamin D.

B. Uji Kuantitatif
Prinsip :
Analisis vitamin D pada umumnya menggunakan analisis Bioassay (analisis
menggunakan hewan percobaan atau manusia), dimana analisis kadarnya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Perhitungan kadarnya menggunakan
kurva standar.
Cara Analisis :
Metode utama analisis kadar vitamin D adalah secara bioassay. Karena ada perbedaan
nilai antirachitis vitamin D dari berbagai sumbernya.

1. Preparasi sampel & Persiapan alat dan bahan

2. Periode deplesi (penghabisan) : pemberian diet Rachitogenic selama 18-25 hari. Tikus
yang digunakan berumur ≤ 30 hari dengan berat badan ≥ 44 g tetapi ≤ 60 g
 3. Pengujian : mulai hari terakhir deplesi sampai 8 atau 11 hari setelah deplesi. Selama
pengujian, tikus terdeplesi diberi vitamin D dengan jumlah diketahui (standard) dan
tidak diketahui (sampel)
4. Jumlah vitamin dalam sampel ditentukan dari warna tulang tibia (tulang kering)
proximal paling akhir atau tulang radius atau ulna distal paling akhir.
5. Dimasukkan 2 ml larutan yang diuji dalam tabung spektrometer dan ditambah 4 ml
larutan jenuh Antimoni-trikhlorida dalam khloroform bebas air
6. Ditunggu 10-15 menit dan serapannya dibaca pada 500 nm
7. Kadar vitamin D dapat dihitung dengan persamaan kurva standar .
Perhitungan Kadar :

µg Tiamin HCl tiap 5mL larutan uji =

Vitamin E (Tokoferol)
A. Uji Kuantitatif
Prinsip :
 Untuk produk makanan umumnya : sampel disaponifikasi dengan reflux, diekstrak
dengan heksan dan diinjeksi ke dalam fase normal kolom HPLC yang disambungkan
pada detektor fluoresensi
 Untuk Margarin dan Minyak nabati : sampel dilarutkan dalam heksan, MgSO 4
ditambahkan untuk mengganti air kemudian difilter dan diuji dengan HPLC
 Untuk minyak : dilarutkan dalam heksan dan diinjeksi secara langsung ke dalam
kolom HPLC
Metode Kromatografi (HPLC) :
 Produk makanan umum
Tambahkan 10 ml pirogallol 6 % ke sampel, campurkan dan aliri dengan N2. Panaskan
pada suhu 70°C selama 10 menit dengan sonikasi. Tambahkan 2 ml KOH 60 %,
campurkan dan aliri dengan N2. Dipanaskan selama 30 menit pada suhu 70°C.
Sonikasi selama 5 menit, dinginkan pada suhu ruang dan tambahkan NaCl dan air.
Ekstrak dengan heksan (0,1% BHT) sebanyak 3 kali. Tambahkan 0,5 g MgSO4 dan
homogenkan. Saringlah dan encerkan sampai volume dengan heksan dan injeksi 20
ml.
  Margarin dan minyak nabati
Tambahkan 40 ml heksan (0,1% BHT) ke dalam 10 g sampel dan homogenkan.
Tambahkan 3 g MgSO4 dan campur, biarkan ³ 2 jam. Saringlah dan encerkan sampai
volume dengan heksan. Injeksi 20 ml.
 Parameter Kromatografi
- Kolom : Hibar RT, Lichrosorb Si60 5mm, 25 cmx4.6 mm
- Fase gerak : 0,9% isopropanol dalam heksan
- Flow : 1 ml/menit
- Detektor-fluoresensi, Ex = 290 nm, Em = 330 nm
Perhitungan Kadar :
area sampel
×[ standar vit . E ] ×volume akhir ( mL)×fp
area standar
Kadar vitamin E=
bobot sampel ( g )
Vitamin K (Menadion)
A. Uji Kuantitatif
Prinsip :
Prinsip yang digunakan dalam analisis vitamin K adalah ekstraksi vitamin kobalamin
dengan asam asetat. Sampel dan standar pembanding yang mengandung vitamin
kobalamin disuntik ke kolom HPLC pada panjang gelombang yang telah ditentukan.
Cara Analisis
Ekstraksi vitamin K diawali dengan penimbangan sampel (contoh; keong macan, kerang
salju, atau kerang tahu) sebanyak 2-5 gr yang mengandung sekitar 40 mikrogram vitamin
B12 dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup. Bufer asetat sebanyak 20 ml dan 0,2 ml
larutan kalium-sianida ditambahkan pada tabung reaksi. Tabung dimasukkan ke dalam
penangas air mendidih selama 30 menit, lalu didinginkan dan diencerkan sampai 50 ml
dengan air suling dan disaring dengan kertas whatman 42. Homogenisasi selama 5 menit
dengan ultrasonic dan didiamkan pada suhu ruang sampai dingin. Penambahan 25 ml
metanol dan ditepatkan sampai volume 50 ml dengan asam asetat 2 %. Sampel
disentrifuse pada 4000 rpm selama 30 menit. Supernatan dipisahkan untuk disuntikkan ke
HPLC, dengan kondisi HPLC sebagai berikut :
Fase gerak : H2O pH 2
Kolom : C18
Kecepatan aliran : 0,5 ml/menit
Pompa : 515 HPLC pump
Injector : Cecil 1100 series
Program : Isokratik
Detektor : UV visible
Panjang gelombang : 280 nm
Sensitivitas : 0,01 AUFS
Suhu : kamar
Tekanan : 6000 psi

Perhitungan Kadar
area sampel
×[ standar vit . K ] ×volume akhir ( mL)×fp
area standar
Kadar vitamin K=
bobot sampel (g )