Asam Amino

Asam amino ditentukan dengan menggunakan HPLC menggunakan kolom yang

sesuai dengan metode

Alat :

1. Dispositif soxhlet

2. Kromatrografi

3. Oven

Bahan :

1. Heksana

2. Bahan Bubuk

3. HCL

4. CaCO3

5. Larutan Standar

Prosedur

1. 50 g bubuk dalam heksana (100 mL) didelusi menggunakan dispositif soxhlet.

2. Kandungan asam amino bebas dalam bahan bubuk delipidasi diekstraksi dalam air
penyuling (100 mL) menggunakan dispositif soxhlet selama 8 jam.

3. Kandungan asam amino bebas dalam air suling siap untuk analisis HPLC.

4. Total protein diekstraksi dari bubuk delipidrat yang digunakan untuk mengekstrak
asam amino bebas dengan 1250µL SDS 2% dalam buffer natrium fosfat 0,05M PH 6,9.

5. Ekstrak akan disentrifugasi pada 10500 rpm selama 10 menit. Lima puluh mikroliter
supernatan dihidrolisis menggunakan 100μL HCl 6N dalam oven pada suhu 110 ° C
selama 24 jam.

6. Setelah hidrolisis, 50μL CaCO3 ditambahkan untuk menetralkan reaksi. Seluruhnya

kemudian disentrifugasi pada 10.500 rpm selama 10 menit dan 10μL supernatan dapat
digunakan untuk analisis HPCL.

7. Larutan standar yang mengandung 1,25μmol / mL setiap asam amino dalam asam
klorida 0,1N akan dibuat.
 Kromatografi dilakukan pada suhu konstan 30°C menggunakan elusi gradien sebagai
berikut. Eluen A adalah buffer berair yang dibuat dengan menambahkan 0,5 mL / L TEA
ke natrium asetat 0,14 M dan menitrasi hingga pH 6,20 dengan asam asetat glasial; eluen B
adalah asetonitril-air (60:40 [v/v]).

Asam lemak dan Fitosteol Asam lemak

Minyak yang diekstrak dari bubuk biji utuh dalam ekstraktor Soxhlet dengan heksana
dianalisis dengan metode AOAC standar

Alat :

1. Soxhlet

2. kromatografi gas kolom kapiler

Bahan :

1. Minyak Mentah

2. Natrium Metoksida

3. HCL

Prosedur :

1. Minyak mentah dianalisis sebagai metil ester untuk menentukan komposisi asam
lemak.

2. Metil ester asam lemak (FAME) diperoleh melalui metode dua langkah dengan
katalis natrium metoksida dan HCl

3. Kemudian dianalisis dengan kromatografi gas kolom kapiler menggunakan kolom

yang sesuai.

4. Identifikasi puncak dilakukan dengan membandingkan waktu retensi metil ester yang
diperoleh dan dianalisis dalam kondisi yang sama dengan minyak yang dikenal
seperti zaitun dan bunga matahari.
Komposisi mineral dan elemen jejak

Mineral utama yang ditemukan dalam kacang adalah Na; K; Ca; Mg; Fe; Mn dan Zn.
Kandungan mineral sampel bubuk ditentukan oleh atom spektrometri serapan/fotometri nyala
sesuai dengan metode.

Alat :

1. Tabung Kaca Pencerna

2. Blok Asap untuk pencernaan

3. Labu ukur 100 ml

4. Botol Plastik

5. Supernatan untuk penentuan mineral

Bahan :

1. Sampel Bubuk

2. Asam perklorat (HClO)

Prosedur :

1. Untuk pencernaan sampel basah, 1g sampel bubuk diambil dalam tabung kaca
pencerna.

2. 12 ml HNO3 ditambahkan ke dalam sampel makanan dan campuran tersebut disimpan

semalaman pada suhu kamar.

3. Kemudian 4 ml asam perklorat (HClO) ditambahkan ke dalam campuran ini dan

disimpan di dalam blok asap untuk pencernaan.

4. Suhu dinaikkan secara bertahap, mulai dari 50°C dan meningkat hingga 250-300°C.

5. Pencernaan selesai dalam waktu sekitar 70-85 menit seperti yang ditunjukkan oleh
munculnya asap putih.

6. Campuran dibiarkan dingin dan isi tabung dipindahkan ke labu ukur 100 ml dan
volume isinya dibuat menjadi 100 ml dengan air suling.

7. Larutan yang telah dicerna basah dipindahkan ke botol plastik yang diberi label secara
akurat.
 8. Masukkan sampel ke dalam banyak tabung untuk disentrifugasi dengan kecepatan 3000
rpm hingga 10 menit. Gunakan supernatan untuk penentuan mineral.

Penentuan Besi (Fe), Seng (Zn), Kalsium (Ca), Mangan (Mn) dan Magnesium (Mg)
dengan Spektrometri Serapan Atom

Sampel yang telah dicerna dianalisis kandungan mineralnya dengan Spektrofotometer

Serapan Atom. Lampu elektroda yang berbeda digunakan untuk setiap mineral. Peralatan
dijalankan untuk larutan standar setiap mineral sebelum dan selama penentuan untuk
memeriksa apakah peralatan tersebut berfungsi dengan baik. Faktor pengenceran untuk
semua mineral kecuali Mg adalah 100.

1. Untuk penentuan Mg, pengenceran lebih lanjut dari larutan asli dilakukan dengan
menggunakan 0,5 ml larutan asli dan air suling yang cukup ditambahkan ke dalamnya
untuk membuat volumenya mencapai 100 ml.

2. Juga untuk penentuan Ca, 1,0 ml larutan litium oksida ditambahkan ke dalam larutan
asli untuk membuka kedok Ca dari Mg.

3. Konsentrasi mineral yang dicatat dalam satuan "ppm" dikonversi menjadi miligram
(mg) mineral dengan mengalikan ppm dengan faktor pengenceran dan membaginya
dengan 1000.

Vitamin

Vitamin yang larut dalam lemak

Vitamin E (α-tokoferol) Khususnya tentang vitamin E (α-tokoferol) dan ß-karoten.

Tokoferol dalam sampel minyak ditentukan dengan HPLC menggunakan kolom

yang sesuai.

1. 10 mg minyak mentah dilarutkan dalam 10 ml heksana.

2. Alikuot larutan ini disuntikkan ke kolom dengan fase gerak heksana/isopropanol

(99/1v/v) dengan laju alir 1 ml/menit.

3. Tokoferol diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensi dengan standar

 otentik.

β-karoten

Nilai konsentrasi β-karoten diperoleh dengan analisis HPLC. Untuk menghindari

kemungkinan degradasi;

Alat :

1. Penangas Air
2. Botol bertutup ulir
3. Tabung penguapan

Bahan

1. Sampel Minyak
2. Heksana
3. Alikuot
4. Larutan eluen
5. Kalium Hidroksida Encer

Prosedur

1. ß-karoten diekstraksi secara langsung dalam sampel minyak dengan pelarut tanpa
penyabunan. Alikuot (2 g) minyak diekstraksi selama 5 menit dengan aseton:
heksana.
2. Setelah ekstraksi, pelarut diuapkan hi ngga kering di bawah aliran nitrogen dan
residu dilarutkan dengan 1 ml larutan eluen dan dimasukkan ke dalam botol bertutup
ulir untuk analisis HPLC.
3. Penentuan β-karoten, terdiri dari perlakuan ekstraksi sampel dengan 1000μl larutan
kalium hidroksida encer (60% b/v) selama 15 menit dalam penangas air bersuhu
45°C.
4. Setelah penyabunan, setiap sampel diekstraksi dengan 1000µl heksana.
5. Sampel diaduk selama 3 menit, disentrifugasi dengan kecepatan 1500 × g selama 5
menit, dan lapisan heksana organik dituang ke dalam tabung penguapan.
 6. Prosedur ini diulangi dan ekstrak heksana kedua digabungkan dengan ekstrak
heksana pertama.
7. Heksana kemudian diuapkan hingga kering dengan aliran gas nitrogen.

Vitamin yang larut dalam air

Teknik analisis yang digunakan untuk menentukan kandungan folat adalah metode

HPLC.26

Alat :

1. Labu ukur 50 ml

2. Labu ukur 10 ml

3. Filter Millipore 0,2μm.

Bahan :

1. Asam folat

2. Larutan methanol

3. Campuran disonikasi

Prosedur :

1. Melarutkan 25,0 mg asam folat dalam 50,0 ml air.

2. 1 ml larutan stok standar asam folat diencerkan hingga 50 ml dengan larutan

metanol 15%.

3. Dua puluh mg bubuk sampel ditimbang dan dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml
dan ditambahkan 15% larutan metanol.

4. Campuran disonikasi (15 menit) dan diencerkan sampai tanda dengan pelarut.

5. 1 ml larutan ini dipindahkan ke dalam labu ukur 10 ml, diencerkan sampai tanda
dengan pelarut yang sama dan disaring melalui filter Millipore 0,2μm.

Tanin

Total tanin ditentukan secara kolorimetri seperti yang dijelaskan.

Alat dan Bahan :

1. Labu takar 100 ml

2. Ekstrak bubuk aseton

3. Pereaksi Folin Ciocalteu

4. CO Na

5. Air panas (70 dengan suhu 80°C)

6. Natrium karbonat

Prosedur :

1. Dalam labu takar 100ml, masukkan: 5ml air suling; 1ml ekstrak bubuk aseton; 5ml
pereaksi Folin Ciocalteu; 10ml larutan jenuh dengan CO Na (larutan jenu3 h disiapkan
dimulai dari 43,75 g natrium karbonat yang dilarutkan dalam 100 ml

2. Air panas (70 dengan suhu 80°C) setelah didinginkan, larutan disaring kemudian
disesuaikan menjadi 125 ml). Setelah pengadukan mekanis, sediaan didiamkan
selama 30 menit.

3. Pengukuran kerapatan optik dilakukan hingga 760nm. Standar kisaran asam tanat
disiapkan dalam kondisi yang sama dengan konsentrasi mulai dari 0 hingga 0,1 g / l.

Asam fitat

Alat dan Bahan

1. Sampel bubuk

2. Besi Klorida

3. NaOH

Prosedur

1. Asam fitat diekstraksi dari sampel bubuk 3g dengan 50ml TCA 3% dengan cara
dikocok pada suhu kamar diikuti dengan sentrifugasi kecepatan tinggi.

2. Asam fitat dalam supernatan diendapkan sebagai fitat besi dengan menambahkan
 besi klorida berlebih dan disentrifugasi.

3. Ferri fitat diubah menjadi ferri hidroksida dengan beberapa ml air dan 3 ml NaOH
1,5N

4. Kemudian kandungan zat besi yang ada dalam sampel diperkirakan

Inhibitor protease: kasus aktivitas inhibitor tripsin

Aktivitas inhibitor tripsin ditentukan menurut metode menggunakan benzoil-DL-

arginin-P-nitroanalide hidroklorida sebagai substrat.

Alat dan Bahan

1. Buffer natrium fosfat

2. Larutan TCA (asam trikloroasetat) 5%

3. Penangas air

Prosedur :

1. Sebanyak 4 g sampel yang telah dihilangkan lemaknya diolah dengan 40 ml buffer

natrium fosfat 0,05M, pH 7,5 dan 40 ml air suling.

2. Sampel dikocok selama 3 jam dan disentrifugasi pada 700g selama 30 menit pada
suhu 15°C.

3. Supernatan diencerkan untuk mendapatkan penghambatan antara 40 dan 60%

aktivitas enzim.

4. Campuran inkubasi terdiri dari 0,5 ml larutan tripsin (5mg/ml), 2 ml 2% (w/v)

Bapna, 1,0 ml buffer natrium fosfat (pH 7,5, 0,1M), 0,4 ml HCl (0,001M) dan
ekstrak sampel (0,1 ml).

5. Total volume campuran inkubasi dipertahankan pada 4,0ml.

6. Inkubasi dilakukan dalam penangas air pada suhu 37°C selama 20 menit, kemudian
ditambahkan 6,0 ml larutan TCA (asam trikloroasetat) 5% untuk menghentikan
reaksi
Hemaglutinin
Aktivitas hemaglutinin diperkirakan sesuai dengan metode ini.
Alat dan Bahan
1. Serbuk
2. NaC1
3. Amonium Sulfat

Prosedur
1. Serbuk (5g) dicampur dengan 0,15M NaCl (1:8, w/v) untuk 48 jam pada suhu 4°C,
dan disaring melalui kisi-kisi 80 mesh.
2. Selanjutnya, proses Filtrat disentrifugasi pada 9168g selama 30 menit, dan supernatan
diendapkan secara fraksional dengan amonium sulfat dengan kejenuhan 10%-100%