KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

1. Siapkan ekstrak secukupnya dan tambahkan sedikit pelarut, aduk rata.

2. Siapkan plat KLT ukuran 3 x 10 cm dan siapkan seperti gambar di bawah ini

1 cm

2 cm

3. Totolkan ke plat KLT secukupnya (kira-kira 5 tetes)

4. Masukkan ke dalam chamber yang berisi eluer :
a. Etanol : etil asetat = 5 : 5
b. Etanol : etil asetat = 2 : 8
c. Etanol : heksana = 4: 6
d. Heksana : etil asetat : etanol = 7 : 2 : 1
e. Kloroform : etil asetat : metanol = 7 : 2 : 1
5. Elusi sampai garis batas atas.
6. Keluarkan dan kering anginkan.
7. Semprot dengan asam sulfat 2%.
8. Lihat di lampu UV.
9. Pertegas gambar noda dengan pencil.
10. Hitung ada berapa noda dan hitung Rfnya.
 UJI FITOKIMIA

Pemeriksaan alkaloid
Satu gram serbuk simplisia dibasakan dengan ammonia 25%, digerus dalam mortir,
kemudian ditambahkan kloroform, digerus kembali lalu fase kloroform disaring. filtrat
kloroform dikocok kuat dengan HCl 2N hingga terbentuk 2 fase. Fase asam (HCl) yang
berada lapisan atas diambil lalu dibagi empat bagian dan diperlakukan sebagai berikut:
(1) bagian pertama digunakan sebagai blangko (pembanding)
(2) bagian kedua ditambahkan pereaksi Mayer, jika menghasilkan kekeruhan atau endapan
berwarna putih menunjukkan adanya alkaloid
(3) bagian ketiga ditambahkan pereaksi Dragendorff, jika terbentuk kekeruhan atau endapan
berwarna jingga kekuningan/ merah bata, menunjukkan adanya alkaloid.
(4) bagian keempat ditambahkan pereaksi Wagner, jika terbentuk endapan coklat,
menunjukkan adanya alkaloid

Pemeriksaan flavonoid
Satu gram serbuk simplisia ditambahkan air, dipanaskan lalu disaring dan didinginkan. filtrat
yang diperoleh ditambahkan asam klorida (HCl 5N) dan serbuk magnesium dikocok kuat dan
ditambahkan, amil alkohol kemudian dikocok kuat, diamkan hingga terbentuk dua lapisan.
Jika terbentuk warna kuning, jingga, atau merah pada lapisan amil alkohol menunjukkan
adanya flavonoid.

Pemeriksaan saponin
Satu gram serbuk simplisia ditambahkan air, dipanaskan lalu disaring. Setelah dingin filtrat
dalam tabung reaksi dikocok kuat-kuat selama lebih kurang 30 detik. Pembentukan buih
sekurang-kurangnya setinggi 1 cm dan persisten selama sepuluh menit serta tidak hilang
setelah penambahan 1 tetes asam klorida encer menunjukkan bahwa dalam simplisia terdapat
saponin.

Pemeriksaan tanin/polifenolat
Satu gram serbuk simplisia ditambahkan air, dipanaskan kemudian disaring. Filtrat dibagi
tiga bagian dan diperlakukan sebagai berikut:
(1) Bagian satu, filtrat ditetesi larutan FeCl3. Terbentuknya warna biru-hitam menunjukkan
adanya tanin dan polifenolat alam.
(2) Bagian dua, filtrat diuji ulang dengan penambahan larutan gelatin 1%. Adanya endapan
putih menunjukkan adanya tanin.
(3) Bagian tiga, filtrat ditambahkan pereaksi Steasny, kemudian dipanaskan dalam penangas
air. Terbentuknya endapan merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Selanjutnya
endapan disaring, filtrat dijenuhkan dengan natrium asetat dan ditambahkan beberapa tetes
larutan FeCl3. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat.

Pemeriksaan kuinon
Satu gram serbuk simplisia dipanaskan dengan air, kemudian disaring. Filtrat ditetesi dengan
larutan NaOH 1N. Terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya senyawa
kelompok kuinon.

Pemeriksaan steroid/ triterpenoid

Satu gram simplisia dimaserasi dengan n-heksana selama 30 menit (tutup rapat), kemudian
disaring. Filtrat n-heksana diuapkan diuapkan di atas cawan penguap hingga kering. Pada
residu diteteskan pereaksi Lieberman-Burchard. Terbentuknya warna ungu menunjukkan
bahwa dalam simplisia mengandung senyawa kelompok triterpenoid, sedangkan bila
terbentuk warna biru-hijau menunjukkan adanya senyawa kelompok steroid.
Tabel 1. Uji Fitokimia
Uji Hasil Keterangan
Mayer
Alkaloid Dragendrof
Wagner
Flavonoid
Saponin
Bagian 1
Tanin/Polifenolat Bagian 2
Bagian 3
Kuinon
Steroid/triterpenoid
Penentuan Kadar Flavonoid Total Ekstrak Etanol Kayu Kuning

1) Penentuan Operating Time dan panjang gelombang maksimum

Dari 100 pm diambil sebanyak 1 ml, sebanyak 1 ml ditambahkan dengan 1 ml AlCl3 10% dan

8 ml asam asetat 5%. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang teoritis

428 nm dengan interval pada waktu 2 menit untuk sampai diperoleh absorbansi yang stabil

untuk OT dan dengan panjang gelombang 350-500 nm untuk lamda maksimum.

2) Pembuatan kurva baku

Dari larutan seri kadar kuersetin dibuat beberapa konsentrasi 15 ppm, 20 ppm, 25 ppm, 30

ppm, dan 35 ppm. Sebanyak 1 ml larutan seri kadar dari masing-maasing konsentrasi

direaksikan dengan 1 ml AlCl3 10% dan 8 ml asam asetat 5%. Diamkan selama 1 menit

pembacaan absorbansi seri kadar dengan menggunakan spektrofotometri UV Vis pada

panjang gelombang maksimum

3) Penetapan kadar flavonoid total

Larutan ekstrak 1000 ppm diambil sebanyak 1 ml, tambahkan 1 ml AlC3 10% dan 8 ml asam

asetat 5%, diamkan selama 1 menit, dilakukan pembacaan absorbansi pada panjang

gelombang maksimum
 UJI ANTIOKSIDAN

A. Persiapan ekstrak
1. Pembuatan ekstrak dengan konsentrasi sebesar 100 ppm
1 g ekstrak pada 50 ml etanol.
2. Pembuatan ekstrak dengan variasi konsentrasi
Lakukan pengenceran menggunakan pelarut etanol dengan membuat variasi
konsentrasi yaitu 5 ppm, 6 ppm, 7 ppm, 8 ppm dan 9 ppm pada tiap masing-
masing sampel.

B. Menyiapkan larutan stock DPPH 50 ppm

Sebanyak 0,5 mg padatan DPPH dilarutkan ke dalam 10 ml etanol.
C. Menyiapkan larutan pembanding
Larutan kontrol yang berisi 2 ml etanol dan 1 ml larutan DPPH 50 ppm.

D. Cara kerja
Untuk sampel uji, disiapkan masing-masing 2 ml larutan sampel dan 2 ml larutan
DPPH. Kemudian, diinkubasi selama 30 menit pada suhu 27℃ hingga terjadi
perubahan warna dari aktivitas DPPH. Semua sampel dibuat triplo. Semua sampel
yaitu sampel ekstrak yang telah diinkubasi diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 517 nm.

Penentuan nilai IC50

Analisis pengujian antioksidan metode DPPH dilakukan dengan melihat perubahan warna
masing-masing sampel setelah diinkubasi bersama DPPH. Jika semua elektron DPPH
berpasangan dengan elektron pada sampel ekstrak maka akan terjadi perubahan warna sampel
dimulai dari ungu tua hingga kuning terang. Kemudian sampel diukur nilai absorbansinya
menggunakan spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 517 nm.

absorbansi blanko DPPH – absorbansi sampel

% Inhibisi = ------------------------------------------------------------ x 100%
absorbansi blanko DPPH
Berdasarkan hasil yang didapat setelah menggunakan rumus tersebut, nilai konsentrasi sampel
dan persentase inhibisi diplot dengan menggunakan persamaan regresi linear (x,y):

y = a + bx
Keterangan :
x: konsentrasi sampel
y: persentase inhibisi

Perhitungan dilanjutkan dengan menilai Inhibition Concentration 50% (IC50). IC50

menunjukkan konsentrasi sampel yang dapat menghambat sebesar 50%. Setelah mendapatkan
persamaan linier (x,y), IC50 dapat dihitung dengan memasukkan nilai 50 pada variabel y,
sehingga diperoleh persamaan:
50−a
IC50 = b

Keterangan :
a: intercept (titik potong garis dengan sumbu y saat x=0)
b: slope (kemiringan garis)