BAB III

METODE PENELITIAN
3.1 Tahapan Kerja Penelitian
pada tahap ini siapkan daun oregano kering. Campurkan daun oregano kering untuk
memperkecil ukurannya. Selanjutnya, saring campuran daun oregano melalui saringan berukuran
30 mesh agar ukuran bubuknya seragam. Selanjutnya, timbang 20 gram serbuk daun yang
berukuran seragam dengan menggunakan timbangan analitik.
Masukkan daun oregano yang telah ditimbang ke dalam labu Erlenmeyer dan campur dengan
pelarut. Pelarut yang digunakan berbeda yaitu etanol dan aquades dengan konsentrasi 96% dan
50%, sesuai dengan perbandingan bahan baku yang telah ditentukan yaitu 1/5 (g/ml), 1/10
(g/ml), 1/15 (g/ml).ml). Alat tersebut kemudian dirakit seperti terlihat pada Gambar 3.1.
Selanjutnya, masukkan labu Erlenmeyer yang berisi campuran daun dan pelarut ke dalam
penangas ultrasonik dan dihubungkan dengan alat lain. Proses ekstraksi dilakukan pada tekanan
atmosfer, suhu 40°C, dan waktu 45 menit.

Ekstrak daun oregano akan dimurnikan melalui dua tahap yaitu:

1. Pemisahan padatan daun
Hasil ekstraksi pada labu erlenmeyer berupa padatan berupa daun oregano, pelarut dan ekstrak.
Pada awal pemisahan, digunakan filter vakum untuk memisahkan daun oregano yang padat,
sehingga hanya menyisakan pelarut dan ekstraknya.
2. Pemisahan pelarut
Gunakan oven vakum untuk menguapkan pelarut untuk memisahkan pelarut dan ekstrak yang
masih tercampur. Untuk pelarut etanol 96%, kondisi pengoperasian oven vakum adalah 45°C dan
0,2 bar. Untuk pelarut etanol 50% dan air suling, kondisi pengoperasian oven vakum adalah
50°C dan 0,2 bar. Perhatikan bahwa tekanan perlu disesuaikan kembali setiap 30 menit. Jika
Anda sudah mendapatkan ekstrak oregano, Anda bisa menghitung rendemennya.
Rumus untuk menghitung tingkat pengembalian adalah sebagai berikut.
Kandungan total fenolik pada ekstrak daun oregano ditentukan dengan menggunakan metode
Folin-Ciocalteu.

A. Pembuatan Larutan Stok Asam Gallat 2000 sore

Timbang 20 mg asam galat dan larutkan dalam tiga pelarut berbeda: etanol 96%, etanol 50%,
dan 10 ml air murni (air suling). Hal ini dilakukan untuk memperoleh larutan asam galat dengan
konsentrasi 2000pm.
B. Membuat larutan Na2CO3 20%.
Timbang total 5 gram natrium karbonat (Na2CO3) dan larutkan dalam 25 ml air suling untuk
membuat larutan natrium karbonat 20%.
C. Kosongkan
Etanol diuji menggunakan tiga konsentrasi ekstrak daun oregano yang berbeda, yaitu akuades
50% dan 96%. Masukkan total 0,1 ml ekstrak daun oregano masing-masing konsentrasi ke dalam
vial. Selanjutnya tambahkan 7,9 ml air suling dan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteu ke dalam vial.
Campuran dalam vial kemudian diaduk menggunakan vorteks selama satu menit. Setelah diaduk,
ditambahkan 1,5 ml Na 2 CO 3 20% ke dalam campuran.
D. Tentukan waktu pengoperasian
Encerkan asam galat 2000 pm dari larutan induk menjadi 1000 pm. Pipet 0,1 ml larutan asam
galat dengan konsentrasi 1000 pm dan masukkan ke dalam botol sampel. Kemudian tambahkan
7,9 ml air suling dan tambahkan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteu. Setelah semuanya dimasukkan,
vorteks sebentar. Setelah divorteks, tambahkan 1,5 ml 20% Na 2 CO 3 . Absorbansi diukur
menggunakan spektrofotometer UV-visibel pada panjang gelombang 765 nm. Amati kapan
larutan mulai menghasilkan nilai serapan yang stabil, yang akan digunakan sebagai operasinya
E. Penentuan panjang gelombang maksimum asam galat
Pipet 0,1 ml larutan asam galat 1000 pm dan masukkan ke dalam botol sampel. Kemudian
tambahkan 7,9 ml air suling dan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteu. Sampel kemudian divorteks
selama satu menit dan ditambahkan 1,5 ml NaCO3 20%.
Inkubasi selama pengoperasian lalu ukur serapannya menggunakan
Spektrofotometer UV-visibel untuk rentang panjang gelombang 600-800
F. Penyusunan Kurva Kalibrasi Asam Gallic
Dalam percobaan ini, larutan asam galat dengan konsentrasi berbeda dibuat dari larutan stok
asam galat. Konsentrasi larutan asam galat yang dibuat adalah 1000pm, 500pm, 250pm, 125pm,
62,5ppm, 15.25pm, dan 15.625pm. Untuk setiap konsentrasi larutan asam galat, ambil 0,1 ml
larutan dan masukkan ke dalam botol sampel terpisah. Selanjutnya tambahkan 7,9 ml air
sulingan dan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteu ke dalam setiap vial sampel. Selanjutnya vial
divorteks selama satu menit dan ditambahkan 20% Na 2 CO 3 . Setelah itu, seluruh vial
diinkubasi dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum tertentu menggunakan
spektrofotometer UV-visibel. Data serapan yang dihasilkan kemudian digunakan untuk membuat
kurva standar asam galat dengan memplot antara serapan dan konsentrasi asam galat.

Dari grafik tersebut diperoleh persamaan linier yang akan digunakan untuk mengukur
konsentrasi asam galat pada sampel berikut dengan mengukur serapan dan menghitung
konsentrasi asam galat dalam sampel menggunakan persamaan linier.
G. Kandungan fenolik total ekstrak
Gunakan pipet untuk memipet sebanyak 0,1 ml ekstrak daun oregano ke dalam botol sampel.
Selanjutnya tambahkan 7,9 ml
Tuangkan air suling dan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteu ke dalam vial. Campuran larutan
kemudian diaduk menggunakan vorteks selama satu menit sebelum ditambahkan 1,5 ml larutan
Na 2 CO 3 20%. Selanjutnya larutan diinkubasi selama waktu yang telah ditentukan dan terakhir
diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum menggunakan spektrofotometer UV-
visibel. Kandungan fenolik total dihitung dengan mensubstitusikan nilai serapan ke dalam
persamaan regresi linier yang sebelumnya diperoleh dari kurva kalibrasi asam galat.
Prosedur analitis untuk pengujian aktivitas antioksidan didasarkan pada (Yen dan Cheng,
1995) sebagai berikut, timbang 1-2 gram sampel, kemudian larutkan dengan pelarut konsentrasi
tertentu (etanol 96%, 50% dan air suling). Ambil 1 mL larutan induk, masukkan ke dalam tabung
reaksi, dan tambahkan 2 mL DPPH 0,002%.
Inkubasi dalam ruangan gelap selama 30 menit. Selanjutnya serapan larutan diukur
menggunakan spektrofotometri UV-Vis untuk mendapatkan panjang gelombang maksimum.
Nilai serapan larutan DPPH dihitung berdasarkan persentase penghambatan (% penghambatan),
rumusnya sebagai berikut:
% penghambatan = serapan blanko - serapan sampel x 100% (3.4) 3.6.4. Kromatografi Gas-
Spektrometri Massa (GCMS) Analisis GC-MS dilakukan pada instrumen GC-MS.

Kondisi operasi yang digunakan adalah suhu kolom dinaikkan dari 60°C menjadi 200°C
dengan laju 4°C/menit, dipertahankan pada suhu awal dan 2000°C selama 5 menit, dan
kemudian ditingkatkan hingga 2800°C pada suhu laju 10°C/menit dan ditahan pada suhu
akhir.Pertahankan suhu selama 20 menit, suhu injektor dan suhu antarmuka masing-masing 210
dan 230.C, tegangan ionisasi 70ev, dan tegangan pengali elektron 1KV. Analisis dilakukan
dalam mode splitless.
3.6.5. koefisien perpindahan massa
Pada penelitian ini, kami mempertimbangkan kedua variabel rendemen dan kandungan total
fenolik maksimum untuk menghitung koefisien perpindahan massa hasil ekstraksi.Proses
ekstraksi setiap kali mengambil 1 ml sampel ekstrak, dan waktu ekstraksi adalah 5 menit, 15
menit. , 30 menit, 45 menit.menit. Koefisien perpindahan massa dihitung menggunakan
persamaan tertentu dan digunakan untuk menganalisis dan memahami perpindahan massa yang
terjadi selama proses ekstraksi

3.2 Lokasi Penelitian

3.3 Alat dan Bahan Penelitian
3.3.1 Alat Penelitian
3.3.2 Bahan Penelitian
3.4 Identifikasi Variable Penelitian
3.5 Cara Kerja Penelitian
3.5.1 Persiapan Bahan Baku