1

TOPIK PRATIKUM METHOD: 6A SELASA 10.40-13.20

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun dan buah labu
siam segar. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol, folin 1 N, Na 2CO3 5%, NaCl,
gelatin, DPPH (diphenilpicrylhydrazyl), isobutanol, reagen TBA (Thiobarbituric
Acid) dan akuades.
Peralatan yang digunakan adalah blender, oven, ayakan 60 mesh, alat-alat
gelas, pengering beku (Snijders Scientific), magnetik strirer, mortal, vortex , kertas
saring, sentrifus, spektrofotometer dan alat-alat dapur.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia dan Biokimia Pangan dan
Hasil Pertanian, Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian,
Universitas Jember pada bulan April – Agustus 2009.

3.3 Metode Penelitian

3.3.1 Persiapan Bahan
3.3.1.1 Persiapan Bubuk Daun dan Buah Labu Siam Kering Oven (pisau, blender,
oven, ayakan) (daun dan buah labu siam)
Daun dan buah labu siam segar diiris tipis-tipis, namun untuk buah labu siam
sebelum diiris dikupas terlebih dahulu. Keduanya tidak dicampur melainkan
merupakan sampel tersendiri. Dengan demikian sampel yang digunakan terdiri dari
daun dan buah labu siam.
Selanjutnya diangin-anginkan kemudian dikeringkan dengan oven suhu 50oC
± 24 jam. Setelah bahan kering lalu diblender untuk mengecilkan ukuran dan untuk

1
 2

menyeragamkan ukuran. Ayakan yang digunakan adalah ayakan dengan ukuran 60

mesh. Diagram alir pembuatannya disajikan pada Gambar 3.1

3.3.1.2 Persiapan Bubuk Daun dan Buah Labu Siam Kering Beku
Daun dan buah labu siam segar diiris tipis-tipis, namun untuk buah labu siam
sebelum diiris dikupas terlebih dahulu. Keduanya tidak dicampur melainkan
merupakan sampel tersendiri. Dengan demikian sampel yang digunakan terdiri dari
daun dan buah labu siam.
Daun dan buah labu siam disimpan dalam freezer pada suhu -20 oC selama 24
jam dan selanjutnya dikeringkan dalam pengering beku. Pengeringan dilakukan
selama 6 hari. Menurut Winarno (1980), pengeringan beku bertujuan untuk
mengeringkan bahan pangan yang sangat peka pada suhu tinggi. Karena antioksidan
yang akan diuji mempunyai sifat sangat peka pada suhu tinggi.
Setelah bahan kering lalu diblender untuk mengecilkan ukuran dan untuk
menyeragamkan ukuran. Ayakan yang digunakan adalah ayakan dengan ukuran 60
mesh. Bahan disimpan dalam freezer untuk analisa selanjutnya. Diagram alir
pembuatannya disajikan pada Gambar 3.1

3.3.1.3 Persiapan Daun dan Buah Labu Siam Kukus

Daun dan buah labu siam dikupas, dicuci dan diiris kecil-kecil. Selanjutnya
dikukus selama 10 menit. Daun dan buah labu siam yang sudah dikukus dihaluskan
menggunakan mortal. Daun dan buah labu siam yang sudah halus langsung diekstrak.
Diagram alir pembuatannya disajikan pada Gambar 3.1

3.3.1.4 Persiapan Daun dan Buah Labu Siam Rebus

Daun dan buah labu siam dikupas, dicuci dan diiris kecil-kecil. Selanjutnya
direbus selama 10 menit. Daun dan buah labu siam yang sudah direbus dihaluskan
menggunakan mortal. Daun dan buah labu siam yang sudah halus langsung diekstrak.
Diagram alir pembuatannya disajikan pada Gambar 3.1

2
 3

3.3.1.5 Persiapan Daun dan Buah Labu Siam Segar (Mentah)

Daun dan buah labu siam dikupas, dicuci, diiris kecil-kecil dan dihaluskan
menggunakan mortal. Daun dan buah labu siam yang halus langsung diekstraksi.
Diagram alir pembuatannya disajikan pada Gambar 3.1

3.3.2 Ekstraksi Senyawa Antioksidan Daun dan Buah Labu Siam.

Metode yang digunakan untuk mengekstrak senyawa antioksidan daun dan
buah labu siam adalah metode ekstraksi tunggal. Kedua bahan tersebut dilakukan
secara terpisah (bahan diekstrak sendiri-sendiri).
Metode Ekstraksi Tunggal. Sebanyak 5 g bahan ditambah dengan 50 ml
pelarut etanol, lalu diekstraksi dengan cara distirer selama 60 menit. Setelah itu,
larutan di sentrifuse (3000 rpm) selama 15 menit. Filtrat ditampung di gelas beaker,
sedangkan residu di ekstraksi kembali dengan pelarut yang sama sebanyak 25 ml.
Ekstraksi residu dilakukan sebanyak 2 kali dengan cara yang sama. Filtrat hasil 3 kali
ekstraksi digabung, disaring dengan penyaring vakum dan selanjutnya ditera dalam
labu ukur 100 ml dengan etanol. Ekstrak yang dihasilkan disebut ekstrak etanol (E-
E). Ekstrak dianalisa kandungan senyawa antioksidannya. Diagram alirnya disajikan
pada Gambar 3.2

3
 4

4
 5

5
 6

Daun dan buah labu siam

Etanol murni Ekstraksi

(Stirer 1 jam)

Sentrifus
(3000 rpm, waktu=15 menit) Residu

Filtrat

Penyaringan vakum

Peneraan
(100 ml)

Ekstrak buah dan daun labu siam

Analisa senyawa antioksidan

Gambar 3.2 Diagram Alir Ekstraksi Senyawa Antioksidan dari Buah dan Daun
Labu Siam.

3.4 Prosedur Analisa

3.4.1 Pengujian Senyawa Antioksidan
3.4.1.1 Kadar Polifenol (filtrat, etanol, folin, aquades, Na2CO3, ) (spektofotometer, tabung
reaksi, vortex mixer,)

6
 7

Sebanyak 1 ml filtrat dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1 ml

etanol, 0,5 ml folin 1 N dan 6,5 ml akuades. Selanjutnya larutan dalam tabung reaksi tersebut
didiamkan selama 5 menit. Setelah itu ditambahkan 1 ml Na 2CO3 5%, divortex dan
didiamkan selama 60 menit ditempat gelap. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 725 nm. Kandungan total polifenol dinyatakan dalam mg/g yang dihitung dari
kurva standar yang dibuat dari asam galat. Kurva standar dibuat dari asam galat pada
berbagai konsentrasi. Kurva standar dibuat dengan cara memplotkan konsentrasi asam galat
(mg) pada sumbu x dan nilai absorbansi pada sumbu y. Persamaan kurva standar untuk
kandungan total polifenol adalah y = 0,1529x + 0,0036. Diagram alirnya disajikan pada
Gambar 3.3
Persamaan kurva standar : y = 0,1529 x + 0,0036

FP
y.
vol filtrat
Kadar polifenol=
gram bahan

3.4.1.2 Kadar Tanin

Total tanin dihitung dari total polifenol dikurangi total non tanin. Cara menghitung
total non tanin adalah sebanyak 2 ml filtrat dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian
larutan dalam tabung ditambahkan 0,5 gram NaCl dan 0,5 gram gelatin. Selanjutnya larutan
dalam tabung reaksi tersebut di vortex dan disentrifus selama 5 menit. Larutan yang sudah
disentrifus diambil filtratnya sebanyak 1 ml dan masukkan dalam tabung reaksi. Larutan hasil
sentrifus ditambahkan 0,5 folin 1N, 1 ml etanol dan 6,5 akuades kemudian didiamkan 5 menit
dan ditambah 1 ml Na2CO3 5%. Larutan tersebut didiamkan dalam tempat gelap selama 60
menit dan diabsorbansi pada panjang gelombang 725 nm. Kandungan total non tanin
dinyatakan dalam mg/g yang dihitung dari kurva standar yang dibuat dari asam galat. Kurva
standar dibuat dari asam galat pada berbagai konsentrasi. Kurva standar dibuat dengan cara
memplotkan konsentrasi asam galat (mg) pada sumbu x dan nilai absorbansi pada sumbu y.
Persamaan kurva standar untuk kandungan total polifenol adalah y = 0,1529x + 0,0036.
Diagram alirnya disajikan pada Gambar 3.4
Persamaan kurva standar : y = 0,1529 x + 0,0036

FP
y.
vol filtrat
Kadar nontanin=
gram bahan

7
 8

Tanin = polifenol – non tanin

3.4.2 Pengujian Aktivitas Antioksidan dan Scavenging Radikal Bebas

Aktivitas antioksidan dianalisa berdasarkan kemampuannya menangkap radikal bebas
(radical scavenging activity/ RSA) diphenilpycrylhydrazyl (DPPH) menurut metode yang
dikembangkan Gadow (1996) dalam Widiyanti (2006) dengan modifikasi. Sampel dibuat
dengan melarutkan sejumlah sampel kering ke dalam 10 ml pelarut masing-masing sampel.
Sebanyak 1 ml DPPH (400µM) dimasukkan ke dalam tabung reaksi, setelah itu ditambah
etanol dan sampel, sehingga total keseluruhan etanol dan sampel adalah 5 ml. setelah itu,
divortex dan didiamkan selama 20 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 517
nm. Aktivitas scavenging radikal DPPH dinyatakan sebagai %.
|kontrol|−|sampel|
% Penghambatan Scavenging Radikal Bebas DPPH ¿ × 100 %
|kontrol|

Ekstrak daun dan daun

labu siam

Ambil 1 ml filtrat + 1
ml etanol

+ 0,5 ml folin 1N + 6,
5 ml akuades

Didiamkan 5 menit

8
 9

+ 1 ml Na2CO3

Vortex

Didiamkan 60 menit d
itempat gelap

Diabsorbansi
725 nm

Gambar 3.3 Diagram Alir Analisa Kadar Polifenol.

Ekstrak buah dan d

aun labu siam

Ambil filtrat 2 ml

+ 0,5 g NaCl + 0,
5g gelatin

Vortex

Sentrifus 5 menit

Residu

Ambil filtrat 1ml + 0,5 folin 1N

+ 1ml etanol + 6,5 akuades

Diamkan 5 menit
9
 10

+ 1 ml Na2CO3

Diamkan 60 menit ditempat gelap dan absorbansi 7

25 nm

Gambar 3.4 Diagram Alir Analisa Kadar Non Tanin.

3.4.3 Pembuatan Ekstrak Pekat Antioksidan

Sebanyak 5 gram buah dan daun labu siam ditambah dengan 50 ml pelarut etanol.
Selanjutnya diekstraksi dengan cara distirer selama 60 menit. Setelah itu disentrifus (3000
rpm) selama 15 menit. Filtrat ditampung dalam gelas beaker, sedangkan residu diekstraksi
kembali dengan menggunakan pelarut yang sama untuk ekstraksi pertama sebanyak 25 ml.
Ekstraksi ini diulang sebanyak 2 kali dengan cara yang sama. Filtrat hasil ketiga digabung
menjadi satu dan disaring dengan penyaringan vakum. Filtrat hasil penyaringan dievaporasi
dengan rotary vakum pada suhu 40o C sampai pelarut habis. Lama evaporasi untuk ekstrak
etanol 20 menit dengan kecepatan 70 rpm, sehingga dihasilkan ekstrak pekat untuk diuji
aktivitasnya dalam VCO. Diagram alir pembuatan ekstrak pekat senyawa antioksidan buah
dan daun labu siam disajikan pada Gambar 3.5

3.4.4 Aplikasi Antioksidan pada Virgin Coconut Oil (VCO)

Dari kesepuluh sampel yang ada (buah segar, buah kukus, buah rebus, buah freeze,
buah oven, daun segar, daun kukus, daun rebus, daun freeze dan daun oven) dipilih yang
mempunyai aktivitas antioksidan yang paling tinggi untuk kemudian diaplikasikan pada
bahan pangan. Antioksidan akan ditambahkan dalam bahan pangan dengan berbagai
konsentrasi (0,05% ; 0,10% ; 0,15% ; 0,20% dan 0,25%). Dari beberapa konsentrasi ini akan
diambil yang mempunyai aktivitas antioksidan yang paling tinggi.

3.4.5 Penentuan Asam Thiobarbutirat (TBA)

Uji asam thiobarbutirat dipakai untuk menentukan adanya ketengikan. Lemak yang
tengik akan bereaksi dengan asam tiobarbutirat menghasilkan warna merah. Intensitas warna
menunjukkan derajat ketengikan (Winarno, 2002).

10
 11

0,1 gram sampel ditambah 1 ml reagen TBA dididihkan selama ±15 menit kemudian
didinginkan. Sampel yang sudah didinginkan ditambah 1 ml isobutanol dan tera dengan
etanol sampai 5 ml, vortex dan sentrifus 5000 rpm selama 5 menit. Kemudian absorbansi
pada panjang gelombang 535 nm.
Angka TBA = mg malonaldehid/ kg minyak
3
¿ × A 535 ×7 ,8
bobot sampel( gram)
A535 = absorbansi pada panjang gelombang 535 nm.
Makin besar angka TBA minyak makin tengik (Sudarmadji et al., 1997).

3.4.6 Kadar Klorofil

Kadar klorofil ditentukan menurut metode Gilpin (2001) dalam Witono (2008).
Sebanyak 0,5 mg buah dan daun labu siam ditera dengan akuades sampai volumenya menjadi
5 ml lalu dimaserasi. Diamati absorbansinya melalui spectrophometer pada panjang
gelombang 665 dan 750 nm. Selanjutnya diasidifikasi dengan menambahkan 4 tetes HCL 1
M, lalu distirer dan disentrifus. Supernatannya diamati kembali absorbansinya pada panjang
gelombang 665 dan 750 nm. Adapun rumus perhitungan kadar klorofil dalam ekstrak adalah
sebagai berikut :
26 ,7 x (665 b − 665 a)
Kadar klorofil(μm. mg −1 )=
L
Keterangan :
665b = absorban 665 nm pra asidifikasi – absorban 750 nm pra asidifikasi
665a = absorban 665 nm pasca asidifikasi – absorban 750 nm pasca asidifikasi
L = panjang kuvet (3 cm)

3.5 Analisa Data

Tahapan penelitian yang bersifat eksploratif diulang sebanyak 1-3 kali dan analisa
data dilakukan secara deskriftif. Untuk mempermudah intrepretasi data, selanjutnya
ditabulasi, diploting dalam bentuk histogram, grafik atau gambar (Steel and Torrie, 1993).

11
 12

Daun labu siam oven

Ekstraksi
Etanol (Stirer 1 jam)

Sentrifus
Residu
(3000 rpm, t=15 menit)

Filtrat

Penyaringan vakum

Evaporasi (suhu = 40oC, waktu = 20 menit dan kecepatan70 rpm)

Konsentrat (ekstrak pekat) daun labu siam oven

Gambar 3.5 Pembuatan Ekstrak Pekat Antioksidan.

12