BAB III

METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental, penelitian ini meliputi persiapan
bahan penelitian yang mencakup pengumpulan, identifikasi sampel, pengolahan
sampel, dan pemeriksaan karakteristik ekstrak, pembuatan ekstrak sereh wangi
(Cymbopogon citratus DC), skrining fitokimia, pemeriksaan mutu simplisia,
pembuatan sediaan suspensi, dan evaluasi sediaan suspensi, dan uji penurunan
kolesterol terhadap mencit putih (Mus musculus) dengan metode

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari-Mei 2019 di laboratorium IPA
Terpadu Universitas Muslim Nusantara Al-Washliyah Medan.
3.3 Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : Alat-alat
gelas, wadah maserasi, Blender, pisau, batang pengaduk, oven, rotary evaporator,
Pengayak nomor 40, cawan penguap, Cawan petri, cawan krus bertutup,
viscometer, piknometer, neraca analitik, lumpang dan stamper, Alat Easy Touch
GCU
3.4 Bahan Penelitian
Bahan-bahan penelitian meliputi: ekstrak sereh wangi, aquadest,
etanol 96% Na. CMC (karboksimetal selulosa), nipagin, sirup simplex, essence,
dan simvastatin, telur puyuh, telur ayam, pakan burung berkicau , PTU 0,1%
3.5 Penyiapan Bahan Tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan sampel,
identifikasi sampel dan pengolahan sampel.

3.5.1 Pengumpulan Sampel

Pengumpulan bahan yang dilakukan secara purposif yaitu tanpa
membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan yang
digunakan untuk penelitian ini adalah sereh wangi (Cymbopogon citratus DC)
yang diperoleh dari Simpang limun. Bagian yang digunakan adalah ponggol
hingga daun.
3.5.2 Identifikasi sampel
Indetifikasi sampel dilakukan di Herbarium Medanense
(MEDAN), Jl. Bioteknologi No. 1 kampus USU, Medan, Sumatra Utara.
3.5.3 Pengolahan Sampel
Pengolahan Sampel dilakukan dengan mengumpulkan bawang
putih, lalu dibersihkan dari kotoran, kemudian dicuci dengan air mengalir lalu
ditiriskan. Setelah itu sampel diiris-iris kemudian di sebar di atas perkamen lalu
dikeringkan di lemari pengering sampai kering (kadar air <10%) selama satu
minggu, Kemudian dihaluskan dengan blender hingga menjadi serbuk, kemudian
diayak dengan pengayak nomor 40, diperoleh serbuk bawang putih dari hasil
pengeringan.
3.6 Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak
Pemeriksaan karakteristik ekstrak meliputi pemeriksaan penetapan
kadar air, penetapan kadar abu, penetapan kadar abu tak larut asam (Ditjen POM,
1997).
3.6.1 Penetapan Kadar Air
a. Penetapan Toluen
Sebanyak 200 ml toluen dimasukan kedalam labu alas bulat, lalu
ditambahkan 2 ml air suling, kemudian alat dipasang dan dilakukan destilasi
selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit,
kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
b. Penetapan Kadar Air Ekstrak
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 gram ekstrak yang telah
ditimbang seksama lalu dipanaskan selama 15 menit, setelah toluen mendidih,
kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi,
kemudian kecepatan destilasi dinaikan sampai 4 tetes per detik. Setelah air
terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan
selama 3 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar
setelah air dan tluen memisah sempurna. Volume air dibaca dengan ketelitian 0,05
ml. Selisih kedua volume air yang terdapat dalam bahan diperiksa kadar air dalam
persen (WHO, 1992).
3.6.2 Penetapan Kadar Abu Total
 Sebanyak 2 gram ekstrak dimasukkan kedalam krus porselin yang telah
dipijarkan dan ditara, kemudian krus dipijarkan perlahan-lahan hingga arang
habis, pemijaran dilakukan pada suhu 500-600 ֯C selama 3 jam kemudian
didinginkan dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan (Ditjen POM, 1979).
3.6.3 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total, didinginkan dengan 25
ml asam klorida encer selama 5 menit, sebagian yang tidak larut dalam asam
dikumpukan, disaring melalui kertas saring bebas abu, kemudian dicuci dengan
air panas, residu dengan kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian
didinginkan dan ditimbang. Kadar abu tidak larut dalam asam dihitung terhadap
bahan yang telah dikeringkan diudara (Ditjen POM, 1979)
3.7 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dilakukan terhadap sampel uji ekstrak bawang
putih meliputi pemeriksaan golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tannin,
triterpenoid/steroid.
3.7.1 Pemeriksaan Alkaloid
Ekstrak ditimbang masing-masing sebanyak 0,5 g kemudian
ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas
penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai sebagai
berikut :
1. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi mayer, reaksi
positif ditandai dengan terbentuknya endapan menggumpal berwarna putih
atau kering.
2. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Bauchardat,
reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan berwarna coklat
sampai hitam.
3. Filtrat sebnyak 3 tetes ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Dragendroff,
reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna jingga.
Alkaloid dianggap positif jika terjadi endapan atau kekeruhan sedikitnya 2
reaksi dari 3 percobaan diatas (Ditjen POM, 1995).
3.7.2 Pemeriksaan Saponin
 Sebanyak 0,1 g ekstrak dimasukan kedalam tabung reaksi, lalu
ditambahkan 5 ml akuades. Kemudian dipanaskan selama limamenit. Setelah itu
disaring dan filtratnya dikocok. Adanya saponin ditunjukan dengan timbulnya
busa setinggi 1-10 cm selama ± 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan
asam klorida 2 N menunjukan adanya saponin (Ditjen POM, 1995).
3.7.3 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g ekstrak disari dengan 10 ml air suling lalu disaring,
filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak
2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi FeCl3, Jika terjadi warna biru atau hijau
kehitaman menunjukan adanya tannin (Ditjen POM, 1995).
3.7.4 Pemeriksaan Steroid
Sebanyak 1 g ekstrak dimaserasi dlam 20 ml n-heksan selama 2
jam kemudian disaring. Filtrat sebanyak 5 ml diuapkan dalam cawan penguap
sampai kering. Kedalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1
tetes asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann-Bouchard). Terbentuknya warna
ungu atau merah yang berubah menjadi biru menunjukan adanya
steroid/truterpenoid (Ditjen POM, 1995).
3.7.5 Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 10 g ekstrak ditimbang kemudian ditambahkan 10 ml air
panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5
ml filtrate ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml
amil alkohol, dikocok kuat dan dibiarkan memisah. Adanya flavonoid ditunjukan
dengan timbulnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alcohol
(Ditjen POM, 1995).
3.8 Pembuatan Ekstrak sereh wangi (Cymbopogon citratus DC)
Serbuk simplisia sereh wangi diekstraksi dengan cara maserasi
dengan etanol.
Cara kerja :
Serbuk simplisia sebanyak 500 g dimasukkan kedalam bejana
tertutup, kemudian dituangkan etanol 96% direndam selama 6 jam pertama sambil
sesekali diaduk, kemudian didiamkan selama 18 jam. Setelah 18 jam, campuran
larutan dipisahkan maserat dengan cara disaring, dipisahkan filtrate dan residu
(Maserat I).
Residu dimaserasi kembali dengan etanol 96% kemudian disaring (Maserat
II) Gabungkan Maserat I dan maserat II lalu didiamkan selama 2 hari. Kemudian
diambil cairan jernihnya lalu dipekatkan dengan alat rotary evaporator pada suhu
50֯C sampai diperoleh ekstrak kental, selanjutnya disimpan dalam desikator
(Depkes RI, 1979).

3.9 Pembuatan Suspensi Ekstrak Sereh Wangi (Cymbopogon citratus DC)

Larutan suspensi yang dibuat pada penelitian ini terdiri atas suspensi
Carboxy Metil Cellulose (CMC) 1%. Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun
salam dengan konsentrasi 5, 10, dan 15%. Suspensi ekstrak daun salam 5% b/v
dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun salam yang telah dibuat sebanyak 5
g kemudian disuspensikan dengan NaCMC 1% b/v sebanyak 100 ml, untuk 10%
b/v dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun salam sebanyak 10 g kemudian
disuspensikan dengan NaCMC 1% b/v sebanyak 100 ml, dan untuk 15% b/v
dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun salam sebanyak 15 g kemudian
disuspensikan dengan NaCMC 1% b/v sebanyak 100 ml.

No. Bahan Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi

5% 10% 15%
1. Ekstrak Sereh 5 10 15
Wangi (g)
2. Na CMC 1% b/v 1 1 1
3. Nipagin (%) 0,1 0,1 0,1
4. Sirup simplex 25 25 25
5. Perasa mint qs qs Qs
6. Aquadest Ad 100 ml Ad 100 ml Ad 100 ml

3.10 Evaluasi Kestabilan Suspensi

Suspensi ekstrak sereh wangi (Cymbopogon citratus DC) dievaluasi
stabilitasnya dengan pengujian menggunakan Climatic chamber sebelum dan
sesudah penyimpanan dipercepat pada suhu 500C dan 350C serta kelembaban
aktif-relatif (RH) 75% masing-masing selama 12 jam sebanyak 5 siklus,
kemudian dilakukan pengujian-pengujian berikut:

Pemeriksaan Organoleptik

Pemeriksaan organoleptik meliputi perubahan warna, bau, rasa dan tekstur.

Suspensi yang telah dibuat diperiksa bau, rasa dan warnanya sebelum dan sesudah
dilakukan penyimpanan yang dipercepat pada suhu 500C dan 350C masing-
masing 12 jam selama 5 siklus.

Pengukuran pH

Pengukuran pH sediaan (suspensi daun kelor) menggunakan pH meter yang telah

dikalibrasi. Suspensi dimasukkan dalam beker gelas kemudian pH meter
dicelupkan ke dalam suspensi. Nilai pH suspensi diketahui dengan melihat angka
yang tertera pada pH meter.

Pengukuran Bobot jenis

Bobot jenis adalah perbandingan bobot zat terhadap air pada volume sama yang
ditimbang pada suhu ruangan sebelum dan sesudah diberi kondisi penyimpanan
dipercepat pada suhu 500C dan 350C masing-masing 12 jam selama 5 siklus:

a. Gunakan piknometer yang bersih dan kosong (W0), lalu isi dengan air suling,
bagian luar piknometer dikeringkan dan ditimbang (W1).

b. Buang air suling tersebut, keringkan piknometer lalu isi dengan cairan sirup
pada suhu yang sama pada saat pengukuran air suling, dan timbang (W2).

Rumus Bj = (W2-W0)/(W2 -W1)

Keterangan:

W0 = Berat Piknometer kosong

W1 = Berat Piknometer tambah air

W2 = Berat Piknometer tambah sediaan

Pengukuran Viskositas

Pengukuran viskositas dilakukan terhadap suspensi yang telah dibuat sebelum dan
sesudah kondisi penyimpanan dipercepat. Pengukuran viskositas dilakukan
dengan menggunakan viskometer Brookfield nomor spindel 61 kecepatan 6 rpm.

Pengukuran Vol.Sedimentasi dan Kemampuan Redispersi

Pengukuran vol. sedimentasi terhadap suspensi yang telah dibuat sebelum dan
sesudah kondisi penyimpanan dipercepat. Pengukuran volume sedimentasi
dilakukan dengan membandingkan antara volume akhir (Vu) sedimen dengan
volume asal (Vo) sebelum terjadi pengendapan. Kemampuan redispersi baik,
apabila suspensi terdispersi sempurna jika dikocok dengan tangan maksimum
selama 30 detik.

3.11 Uji Aktivitas sebagai Anti kolesterol

3.11.1 Persiapan Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 25 ekor mencit putih
(Mus musculus) yang berumur lebih kurang 3 bulan dengan berat badan 20-30
gram. Hewan uji dibagi dalam 5 kelompok, yaitu 3 kelompok perlakuan (P1, P2,
P3), dan dua kelompok kontrol (K+ dan K-). Masing-masing kelompok terdiri
dari 5 ekor mencit. Sebelum diberikan perlakuan, semua hewan uji diaklimatisasi
Selama 3 hari untuk mengadaptasikan mencit pada kondisi lingkungan. Setelah itu
mencit diberi pakan standar PBB (Pakan Burung Berkicau) selama 7 hari.

3.11.2 Peningkatan Kadar Kolesterol Mencit Putih

Pemberian pakan hiperkolesterol dilakukan selama 25 hari, pakan

hiperkolesterol terdiri dari 30 gram kuning telur puyuh, PTU (Propiltiourasil)
0,1% dan air sampai 1000 mL serta 5 kg pakan ayam broiler. Pembuatan pakan
hiperkolesterol yaitu dengan cara PTU 100 mg dilarutkan ke dalam 1000 mL
aquades, telur puyuh dilarutkan dengan larutan PTU yang sudah dibuat. Selama
15 hari pakan ini diberikan kepada mencit dengan masing-masing volume 0,5 per
mencit dengan cara disondekan. Selanjutnya 10 hari ke depan diberikan pakan
ayam broiler untuk meningkatkan kadar kolesterol hewan uji. Setelah 25 hari,
dilakukan pengecekan seluruh mencit (25 ekor) untuk diketahui kolesterol mencit
setelah pemberian pakan hiperkolesterol. Pengecekan kolesterol ini dilakukan
dengan menggunakan GCU (alat tes kolesterol). Sebelum pengecekan, mencit
dipuasakan selama 10-12 jam, pengukuran kolesterol mencit tersebut merupakan
kolesterol total mencit setelah pakan hiperkolesterol.

3.11.3 Perencanaan Dosis

Dosis ekstrak sereh wangi yang digunakan adalah pada kelompok P1

digunakan 100 mg/gBB, P2 dengan dosis 200 mg/gBB, P3 dengan dosis 300
mg/gBB, kontrol positif (K+) dengan dosis simvastatin 0,026 mg/gBB (faktor
konversi 0,0026) dan untuk kontrol negatif (K-) diberikan aquades.

3.11.4 Uji Penurunan Kolesterol pada Mencit Putih (Mus musculus)

Hewan uji diberikan perlakuan kepada masing-masing kelompok berupa

dosis yang sudah dibuat dengan 0,5 mL per mencit selama 12 hari. Kadar
kolesterol dicek setelah 12 hari perlakuan. Sebelum itu, mencit dipuasakan selama
10-12 hari.

3.11.5 Pengukuran Kadar Kolesterol pada Mencit Putih (Mus musculus)

Pengukuran dilakukan dengan menggunakan alat Easy Touch GCU Alat

dikalibrasi terlebih dahulu dengan nomor kode yang disesuaikan dengan test strip
yang digunakan. Test strip diselipkan pada tempat khusus pada alat tersebut,
kemudian pada layar akan muncul gambar “tetesan darah” yang menandakan alat
siap untuk digunakan. Setelah ekor mencit didesinfektan dengan etanol 70%,
ujung ekor digunting, tetesan darah pertama dibuang, tetesan berikutnya
diteteskan pada test strip yang terselip pada alat. Sejumlah tertentu darah akan
terserap sesuai dengan kapasitas serap test strip sampai terdengar bunyi bip,
setelah itu pendarahan mencit dihentikan. Hasil akan terlihat pada layar setelah
150 detik untuk uji kolesterol.