Alat yang digunakan

Alat-alat gelas (Iwaki Pyrex), autoklaf (Hirayama), batang pengaduk, cawan petri
(Iwaki Pyrex), cotton bud, gunting, inkubator (Memmert), jangka sorong (ATS), blender,
Laminar Air Flow (Esco), lumpang dan stamper, magnetik stirrer (heidolph), oven
(Memmert), pinset, pipet tetes, pisau, rotavapor (heidolph), sendok tanduk, sendok besi,
spoit, termometer, timbangan analitik (mettler toledo) dan viskometer Brookfield model
RVT.

Bahan yang digunakan

Aquades, biakan murni (Escherichia coli, Salmonella thypi), etanol 70%, karbopol 940,
gliserin, kertas pH universal (nesco), medium glukosa nutrient agar, medium glukosa nutrient
broth, metil paraben, sampel ekstrak buah karamunting, trietanolamin.

Metode Kerja
1. Penyiapan sampel
a. Pengambilan sampel (Mahmudah, 2011: 39; Rukmana, 2004: 64)
Buah karamunting yang digunakan sebagai sampel adalah buah yang telah masak
fisiologi. Lokasi pengambilan buah adalah kota Tarakan, Provinsi Kalimantan Utara.
b. Pengolahan sampel (Mahmudah, 2011: 39)
Buah karamunting yang telah dipetik, dibersihkah dan dilakukan sortasi. Kemudian
buah dipotong-potong dan dikeringkan di bawah sinar matahari secara langsung. Setelah
kering buah diserbukkan dengan diblender dan sampel siap diekstraksi.

2. Ekstraksi sampel
Ekstraksi buah karamunting dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi buah
karamunting dengan pelarut etanol 70% (Mahmudah, 2011: 39). Buah karamunting yang
telah diserbukkan, ditimbang sebanyak 300 gram, lalu dimasukkan ke dalam wadah maserasi
dan ditambahkan etanol 70% hingga terendam semua dan ditutup rapat, dibiarkan selama 24
jam sambil diaduk sekali-kali. Disaring dan dipisahkan ampas dan filtratnya selanjutnya
dimaserasi kembali dengan cairan penyari yang baru. Hal ini dilakukan tiga kali masing-
masing 1 X 24 jam. Ekstrak yang diperoleh diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental
3. Uji kadar hambat ekstrak buah karamunting
a. Pembuatan medium
1) Komposisi Glukosa Nutrient Agar (GNA)
Glukosa 10 gram
Ekstrak daging 5 gram
Agar 15 gram
Pepton 10 gram
Natrium Klorida 2,5 gram
Air suling hingga 1000 ml
Cara pembuatan :
Semua bahan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian dilarutkan dengan air
suling hingga 800 ml, lalu dipanaskan sampai larut. Kemudian dicukupkan volumenya
dengan air suling hingga 1000 ml, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC
selama 15 menit.

2) Medium Glukosa Nutrient Broth (GNB)

Ekstrak daging 5 gram
NaCl 2,5 gram
Pepton 10 gram
Air suling ad 1000 ml
Cara pembuatan:
Semua bahan dimasukkan kedalam gelas Erlenmeyer dilarutkan dengan air suling
sampai 800 ml, kemudian di panaskan sampai larut, lalu dicukupkan dengan air suling hingga
1000 ml. Selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15
menit.

b. Penyiapan mikroba uji

1. Peremajaan mikroba uji Escherichia coli dan Salmonella thypi diambil satu ose dari
biakan murni kemudian diinokulasikan pada medium GNA miring, lalu diinkubasi pada
suhu 37o C selama 24 jam.
2. Pembuatan suspensi bakteri (Chatimah, 2009: 39). Kultur bakteri umur 1 X 24 jam yang
telah diremajakan dalam media GNA miring disuspensikan dengan NaCl fisiologis
(NaCl 0,9%) kemudian diukur kekeruhannya 25% T pada spektrofotometer UV-Vis.
3. Pengujian Daya Hambat
 Uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan medium
GNA, 1 ml suspensi mikroba uji diinokulasikan dalam 10 ml medium GNA lalu dituang
ke dalam cawan petri, kemudian paper disk yang telah direndam dalam vial yang berisi
sampel dengan konsentrasi masing-masing P1, P2, P3, P4, dan 5 diletakkan dalam cawan
petri yang telah berisi medium dan suspensi mikroba. Diinkubasi 1 x24 jam pada suhu
37o C, lalu diamati dan diukur daerah hambatan yang terbentuk.

4. Pembuatan sediaan gel

a. Rancangan formula
Tabel. Rancangan sediaan gel antiseptik ekstrak buah karamunting
No Nama Bahan F1 F2 F3 F4 F5 F6
1 Ekstrak buah KR (%) 0 5 10 15 20 25
2 Karbopol (%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
3 TEA (%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
4 Korigen odoris (melon) (gtt) 8 8 8 8 8 8
5 Natrium metabisulfit (%) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
6 Gliserin (%) 1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
7 Aquades (ml) 200 200 200 200 200 200

b. Pembuatan formula
Sediaan gel dikerjakan dengan cara basis karpobol ditambahkan dengan air suling suhu 70 °C
sebanyak 20 ml dalam gelas kimia, didiamkan hingga mengembang selama 1 x 24 jam.
Kemudian TEA dicampurkan ke dalam basis lalu dihomogenkan, ditambahkan metil paraben
yang sebelumnya telah dilarutkan dengan 15 ml air suling panas suhu 90 °C dihomogenkan.
Dilarutkan ekstrak buah karamunting ke dalam gliserin, lalu dimasukkan basis ke dalam
larutan ekstrak sedikit demi sedikit, dihomogenkan. Kemudian ditambahkan sisa air setelah
itu dihomogenkan.

5. Uji karakteristik sediaan gel

a. Uji organoleptik
Analisis organoleptis dilakukan dengan mengamati perubahan-perubahan bentuk, warna, dan
bau dari sediaan gel ekstrak buah karamunting yang diberi basis karbopol.
b. pH
Pengukuran pH dilakukan dengan mencelupkan kertas pH universal ke dalam sediaan gel yg
telah dibuat.
c. Uji viskositas
Pengukuran viskositas dilakukan terhadap sediaan gel dengan menggunakan viskometer
Brookfield dengan spindel no.5, no.6 dan no.7. Hal ini dilakukan dengan cara mencelupkan
spindle ke dalam sediaan gel kemudian dilihat viskositasnya.

6. Uji efektifitas sediaan gel

a. Uji daya antiseptik
Setelah diperoleh konsentrasi karbopol yang sesuai dengan karakteristik gel antiseptik pada
umumnya, maka dilanjutkan pengujian efektifitas sediaan gel dengan konsentrasi ekstrak
buah karamunting. Metode yang digunakan adalah metode replika.

1) Metode replika (Lund, 1994: 599)

Kontrol
Telapak tangan dicuci dengan air kran, kemudian dikeringkan. Selanjutnya sidik ibu
jari ditempelkan pada media padat nutrient agar dalam cawan petri. Media ini diinkubasi
pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi jumlah koloni dihitung.

Sediaan uji

Telapak tangan dicuci dengan air, kemudian dikeringkan. Selanjutnya pada telapak
tangan diteteskan gel kemudian diratakan dan didiamkan selama satu menit. Selanjutnya sidik
ibu jari ditempelkan pada media padat nutrient agar dalam cawan petri. Media ini diinkubasi
pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah diinkubasi jumlah koloni dihitung

b. Pengumpulan dan analisis data

Data hasil pengujian yang diperoleh dikumpulkan dan dianalisis.

Uji Sifat Fisika dan Kimia Gel

Uji sifat fisika dan kimia gel yang
dilakukan meliputi pengamatan
organoleptis, pengujian daya sebar,
daya lekat dan pengukuran pH.
Analisis Data
Analisis data pada penelitian ini
menggunakan perangkat lunak SPSS
dengan ANOVA dan dilanjutkan
dengan uji Post Hoc Test Multiple
Comparrison Tukey
Alat Penelitian
Alat yang diperlukan dalam proses ekstraksi pada penelitian ini yaitu
oven, neraca analitik, waterbath, dan rotary evaporator. Sedangkan alat yang
digunakan untuk uji anti mikroba adalah autoklaf, timbangan analitik, Bunsen,
Erlenmeyer 250 ml, Erlenmeyer 500 ml , cawan petri, tabung reaksi, rak
tabung reaksi, paper disk, beaker glass, labu ukur 5 ml, gelas ukur,
microplate, mikropipet, pinset, pipet ukur, jangka sorong, colony counter,
jarum ose, stirer, kertas label, kertas cakram, kapas, laminar air flow, hot
plate, lemari es, plastik wrap, botol semprot, inkubator, inkubator CO2 5% dan
aluminium foil, hot plate, vortex, botol flacon, Bunsen, plastic wrap, mikroskop
stereo APD colony counter.

Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah karamunting,
bakteri Escherichia coli, Salmonella, media NA (Nutrient Agar), MHA ( Mueller
Hinton Agar), aquades steril, alkohol 70 %, PEG 400, kloramfenikol , NaCl 0,9
%, dan etanol 70%.

Prosedur Kerja
Pembuatan Ekstrak buah karamunting
Sebanyak 250 gram serbuk buah karamunting dimasukkan kedalam
labu erlenmyer 1000 ml dan ditambahkan pelarut etanol p.a sebanyak 1000
ml, kemudian direndam selama 24 jam. Ampas yang diperoleh disaring
dengan penyaring Buchner dan dimaserasi kembali dengan pelarut yang
sama. Tahap ini dilakukan selama 3 hari dengan mengganti pelarutnya setiap
1x24 jam sampai filtratnya berwarna bening.
Filtrat hasil maserasi dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu
30-40 ° C. Suhu rendah digunakan untuk menjaga agar senyawa aktif tidak
mengalami kerusakan, sampai didapatkan ekstrak pekat untuk uji aktivitas
antibakteri. Untuk menghilangkan sisa-sisa pelarut dari ekstrak buah
karamunting dilakukan penyemprotan dengan gas N2 (Nitrogen Cair). Gas N2
ini akan membuat ekstrak yang pekat mengkristal, sehingga antara sisa- sisa
pelarut akan terpisah dengan ekstrak tumbuhan.

Proses Persiapan Bakteri Escherichia coli dan Salmonella

a. Sterilisasi Alat
Sterilisasi merupakan suatu usaha untuk membebaskan atau
memusnahkan alat-alat atau bahan-bahan dari segala macam bentuk
kehidupan, terutama mikroorganisme (Safitri, dkk., 2010). Alat yang
digunakan disterilkan dengan menggunakan oven pada suhu 16°C-17°C
selama 1 jam sedangkan bahan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C
tekanan 1 atm selama 15 menit. Alat yang tidak tahan terhadap panas tinggi
disterilkan dengan alkohol 96%.
b. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Media NA dibuat dengan cara melarutkan 20 gram bubuk media NA
dalam aquades, sampai volume 1 Liter. Larutan media dipanaskan sampai
bubuk media NA benar-benar larut, dan dimasukkan dalam tabung reaksi
masing-masing 5 mL. Kemudian dilakukan sterilisasi menggunakan autoklaf
selama 15 menit pada tekanan 1 atm, suhu 121°C. Tabung reaksi selanjutnya
dimiringkan agar media NA didalamnya membeku berbentuk miring (Dewi,
2010).

c. Media Muller Hinton Agar (MHA)

Prosedur pembuatan media MHA adalah ditimbang medium sebanyak
38,0 gram kemudian medium disuspensi ke dalam 1 L aquades atau
deionized. Medium dipanaskan sampai mendidih agar tercampur dengan
sempurna selama 1 menit. Disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit
pada suhu 118-121°C, tekanan 1-2 atm. Ditunggu hingga agak dingin sekitar
suhu 45-50 °C. Kemudian dituangkan ke dalam cawan petri. Untuk membuat
medium cokelat agar, tambahkan darah domba di 80°C selama 10 menit.
Inokulasi mikroorganisme ke dalam cawan dan inkubasi pada suhu 37°C
selama 24 jam.

d. Pembuatan Inokulum Bakteri

Inokulum bakteri diambil 1 ose dan ditambahkan NaCl 0,9% steril
sebanyak 5 mL. Selanjutnya dihomogenkan dengan vortex. Setelah itu
larutan tersebut dibandingkan dengan larutan Mc Farland. Apabila
kekeruhan suspensi bakteri uji adalah sama dengan kekeruhan pada larutan
Mc Farland, maka konsentrasi suspensi bakteri adalah 108 CFU/mL (Fatisa,
2013). Larutan standart Mc Farland, komposisi terdiri dari larutan asam sulfat
1% sebanyak 9,95 ml, larutan barium klorida 1,175% sebanyak 0,05 ml. Cara
pembuatannya kedua larutan di atas dicampurkan ke dalam tabung reaksi
dan dikocok homogen (Silaban, 2009).

e. Uji Aktivitas Antibakteri

Metode ini menggunakan prosedur difusi standar menggunakan
blank disk paper (diameter 6 mm) yang diletakkan di atas agar. Metode ini
memungkinkan penentuan kemapuan senyawa aktif dalam buah karamunting
, dengan melihat dan mengukur diameter dari zona hambat yang merupakan
hasil dari difusi senyawa aktif ke dalam medium di sekitar blank disk paper.
Dimasukan suspensi bakteri E.coli dan Salmonella sebanyak 200 μl ke dalam
cawan petri steril, kemudian dimasukkan media MHA yang masih cair
sebanyak 20 ml, dan media dibiarkan memadat (Bauer et al dalam Huda,
dkk., 2012). Di atas medium MHA diletakkan kertas cakram steril yang telah
direndam dengan ekstrak metanol, kloroform p.a dan n-heksana p.a dengan
konsentrasi 75% selama 60 menit. Dilakukan kontrol positif dengan perendam
kertas cakram pada kloramfenikol sebanyak 250 mg kloramfenikol dilarutkan
dalam 100 pelarut (PEG 400) dan kontrol negatif menggunakan PEG 400.
Kertas cakram tersebut diletakkan di atas permukaan media bakteri
menggunakan pinset dan ditekan sedikit. Kemudian diinkubasi pada suhu
37°C selama 24 jam (Suganda, 2003).

f. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum KHM dan KBM

Penentuan KHM dan KBM dilakukan dengan menggunakan metode
mikrodilusi padat menggunakan microplate steril. KHM (Kadar Hambat
Minimum) adalah kadar atau konsentrasi minimal dari ekstrak buah
karamunting yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji, sedang
kan KBM (Kadar Bunuh Minimum) adalah kadar atau konsentrasi minimal
yang mampu membunuh bakteri uji, yang ditunjukkan dengan tidak adanya
koloni atau jumlah koloni < 0,1 % dari Original Inoculum (Winarsih, dkk, 2011).
Original Inoculum adalah kontrol kuman yang berisi bakteri uji dan media.
Selain kontrol kuman, digunakan juga kontrol bahan yang berisi bahan uji
(ekstrak buah karamunting) dan aquades steril untuk mengetahui ada
tidaknya mikroba yang tumbuh pada bahan uji (Prihantoro, dkk,2006).

Penentuan nilai KHM

Penelitian ini menggunakan metode pengenceran secara bertingkat.
Tahap dilusi diulang tiga kali untuk masing-masing bakteri Suspensi bakteri
yang digunakan adalah dengan konsentrasi 106 CFU/mL dengan media NB.
Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, diamati kekeruhan dari
tiap konsentrasi. Nilai KHM ditentukan dari konsentrasi uji yang mempunyai
larutan lebih keruh dari kontrol mikroba.

P
enelitian ini menggunakan varias
i konsentrasi sebagai berikut
500 mg/ml, 250
mg/ml,
125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,25 mg/ml, 15,6
mg/ml, 7,8 mg/ml, 3,9 mg/ml
terhadap bakteri
S.
aureus
dan
E.
coli.
Pert
ama
-
tama dibuat konsentrasi 1000000 mg/ml
,
selanjutnya ekstrak
1000000 mg/ml
dimasukkan ke dalam sumuran pertama sebanyak 200
μ
l (sebag
ai kontrol bahan) dan ke dalam sumuran kedua
dimasukan 150
μ
l
ekstrak
dan ketiga sebanyak 100
μ
l
ekstrak
.
Kemudian sumuran ke
-
4 diisi 50
μ
l
ekstrak
, selanjutnya dari sumuran ke
-
3 sampai ke
-
10 diisi
dengan aquades steril sebanyak 100
μ
l kecuali pada sumuran ke 4