Bahan dan Metode

2.1. Persiapan pembuatan ekstrak gelatin

Produk yang berasal dari sotong ini dicuci beberapa kali dengan air untuk
menghilangkan residu dan tinta gelap. Gelatin diekstraksi dari kulit luar sotong.
Pertama, protein non-kolagen dihilangkan menggunakan larutan NaOH 0,05 M
dengan perbandingan 1/10 (w / v) selama 2 jam pada suhu 4° C yang diganti setiap 30
menit. Kemudian, kulit dicuci beberapa kali dengan aquades 4° C untuk mencapai pH
netral. Untuk mengekstrak gelatin, kulit direndam dalam asam asetat 0,1 M dengan
perbandingan 1:10 (b / v) dan dihidrolisis dengan pepsin pada 5 U / g kulit dan
diinkubasi selama 48 jam pada suhu 4° C (Jridi dkk., 2016). Untuk menonaktifkan
enzim, pH kemudian dinaikkan menjadi 7,5 menggunakan 10 M NaOH dan diaduk
selama 1 jam pada suhu 4° C. Kemudian, kulit diinkubasi pada suhu 40° C selama 18
jam dengan agitasi untuk mengekstrak gelatin. Akhirnya, sampel disentrifugasi pada
10.000 g selama 30 menit pada suhu 4° C untuk menghilangkan bahan yang tidak
larut. Gelatin berada dalam supernatan (gelatin kulit sotong) yang dibekukan
dikeringkan menggunakan (Bio-block Scientific Christ ALPHA 1e2, IllKrich-Cedex,
Perancis) dan disimpan dalam suhu dingin (4° C) sampai digunakan. Untuk membuat
larutan gelatin aktif, HAE dilarutkan dalam ekstrak gelatin dengan konsentrasi 50
mg / mL.

2.2. Persiapan Pembuatan Ekstrak Henna Aqueous

Tumbuhan daun Lawsonia inermis didapatkan dari kota Gabes- Tunisia dan
disimpan pada suhu 20° C. menurut Mittal and Aguwa (1983) Ekstrak air Henna
(HAE) dibuat, dengan sedikit modifikasi. Singkatnya, setelah mencuci daun henna
dijemur dan ditumbuk menjadi bubuk. Sebanyak lima puluh gram lalu dicampur
dengan 500 mL air suling dan diaduk selama 24 jam pada suhu kamar (25 C).
Akhirnya, campuran disentrifugasi (10.000 g, 15 menit, 4 C) untuk menghilangkan
bahan yang tidak larut, supernatan dikumpulkan selanjutnya dikeringkan dan
dibekukan.

2.3. Persiapan Sampel Daging

Otot sapi (Longissimus dorsi) diperoleh dari pasar lokal di Kota Valencia,
Spanyol. Pertama dilakukan penyembelihan, Otot dipotong menjadi 18 kotak, dengan
ukuran 5x5x2 cm, dan dibagi dalam tiga kelompok sesuai dengan perlakuan: sampel
 kontrol tanpa perlakuan; sampel dicelupkan ke dalam larutan gelatin selama 30 detik
pada suhu 40°C dan sampel dicelupkan ke dalam larutan gelatin yang diperkaya
dengan HAE selama 30 detik pada suhu 40°C. Setelah perlakuan, semua sampel
ditimbang dan disimpan pada suhu 4° C tanpa kemasan. 18 sample (enam dari setiap
kelompok) dikeluarkan dari ruang pada kelompok penyimpanan 1, 3, 6 dan 8 untuk
mikroba, sensorik, asam amino bebas dan analisis fisika-kimia.

2.4. Penurunan Berat

Penurunan berat badan sampel daging pada hari ke 3, 6 dan 8 hari dihitung
menggunakan persamaan: WHC (%) 1⁄4 (W0 Wi) / W0 100, dimana W0 adalah berat
awal sampel dan Wi adalah berat sampel yang sama setelah 3, 6 dan 8 hari di
penyimpanan dingin.

2.5. Penghitungan warna, pH and aktivitas cairan

Warna bagian dalam daging sampel ditentukan menggunakan colorimeter CR-
410 didapat dari (Kepala Pengukur Minolta Chroma Meter, Osaka, Jepang) dengan
iluminan D65 dan 10x pengamat. Dengan demikian, gelatin dikeluarkan dari sampel
daging dan dilakukan tiga kali pengukuran yang berbeda dari tiga permukaan kubus
yang berbeda. Instrumen dikalibrasi menggunakan pelat putih standar. Nilai rata-rata
ditentukan dengan mengambil pengamatan dari enam sampel daging yang berbeda
pada hari ke 1, 3, 6 dan 8 penyimpanan. Hanya sampel kontrol (n = 6) yang dievaluasi
pada hari ke-1 karena tidak terjadi perubahan pada gelatin dan gelatin þ HAE. Tingkat
kecerahan CIE (L *), kemerahan (a *) dan kekuningan (b *) dicatat. Hue dihitung
menggunakan rumus standar [Arc tan (b * / a *)], sedangkan chroma (C *) dihitung
dengan persamaan: C * 1⁄4 (a *2 + b*2)1/2 .
Untuk mengukur pH daging dari setiap perlakuan dan hari penyimpanan, 5
gram sampel dihomogenisasi dalam 20 mL air suling selama 2 menit menggunakan
Stomacher (Instrumen IUL, Barcelona, Spanyol).
Aktivitas air (aw) diukur dengan menggunakan pengukur aktivitas air
laboratorium cepat (Gbx, Romans sur Ise re Ce dex, Prancis). Singkatnya, setelah
kalibrasi dengan natrium klorida dan kalium sulfat, bagian internal dari setiap sampel
diletakkan di instrumen dan diukur.

2.6. Oksidasi Lemak (Lipid)

 Oksidasi lemak dievaluasi menurut penelitian oleh Witte, Krause, dan Bailey
(1970). Singkatnya, 5 g sampel daging dan 20 mL asam trikloroasetat (TCA)
diencerkan menjadi 5% dihomogenisasi dalam penghomogen Polytron (PT 2100,
Kinematica AG, Swiss) selama 5 menit. Homogenat disentrifugasi pada 12.000 g
selama 10 menit pada suhu 4° C. 4 mL supernatan dicampur dengan 4 mL asam
thiobarbituric (TBA) 0,02 M dan diinkubasi dalam water bath pada suhu 100° C
selama 60 menit. Kemudian, campuran disentrifugasi pada 2500 g selama 10 menit
pada suhu 4° C. daya serap supernatan diukur pada 532 nm. Nilai zat reaktif TBA
(TBARS) dihitung menggunakan kurva standar senyawa organik malonaldehida
(MDA) dan hasilnya ditampilakn dalam μmoles MDA / g sampel.

2.7. Kandungan Metmyoglobin

Kandungan metmioglobin (Mmb) ditentukan menurut penelitian sebelumnya
dari Fern andez-Lo pez et al. pada tahun 2003. Singkatnya, 5 g daging dihomogenisasi
dengan 50 mL buffer fosfat 0,04 M dan pH 6,8 selama 15 detik pada suhu 4° C
menggunakan alat penghomogen yaitu Polytron. Kemudian sampel disentrifugasi
selama 30 menit dan 15.000 rpm pada suhu 4° C. Supernatan disaring melalui glass
wool dan larutan yang diperoleh dianalisis menggunakan spektrofotometer untuk
mengukur absorbansi pada 525, 572 dan 730 nm. Persentase metmioglobin ditentukan
menurut rumus: Mmb (%) 1⁄4 1.395 ((A572 A730) / (A525 A730)) 100.

2.8. Kandungan Besi heem

Kandungan besi heme total ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya
oleh Clark, Mahoney, dan Carpenter pada tahun 1997. Sampel daging (2 g)
dihomogenisasi dengan 9 mL aseton yang diasamkan (aseton 90%, air deionisasi 8%,
HCl 2%). Homogenat ditempatkan selama 1 jam pada 25 C° dalam gelap dan
kemudian disaring melalui glass wool. Absorbansi filtrat ditentukan pada 640 nm.
Jumlah zat besi heme dihitung dengan rumus: Zat besi heme (mg / g daging) 1⁄4 A640
680 0,0882.

2.9. Analisis Mikrobiologi

Uji aktivitas mikrobiologi dilakukan sesuai dengan metode yang dijelaskan
oleh Berghe dan Vlieinck pada tahun 1991. 10 g sampel dihomogenisasi dengan 90
mL NaCl 0,85% untuk menentukan jumlah bakteriologis dalam pengenceran yang
 berbeda. Jumlah bakteri aerobik total yang layak ditentukan dengan cara metode pelat
tuang. Cawan yang diinokulasi diinkubasi pada 37° C selama 2 hari untuk jumlah
total yang layak, dan pada 10° C selama 7 hari untuk jumlah bakteri psikrotrofilik.
Semua jumlah mikroba diubah menjadi logaritma unit pembentuk koloni per gram
daging atau (log cfu / g).

2.10. Asam Amino Bebas

Asam amino bebas dianalisis menurut penelitian oleh Flores, Aristoy, Spanier,
dan Toldra pada tahun 1997 dan Bidlingmeyer, Cohen, Tarvin, dan Frost pada tahun
1987 dengan sedikit modifikasi. 5 g sampel dihomogenisasi dengan 20 mL 0,01 HCl
dalam Stomacher (Instrumen IUL, Barcelona, Spanyol) pada suhu 4° C selama 8
menit. Homogenat disentrifugasi pada 10.000 g selama 20 menit pada suhu 4° C dan
supernatan disaring melalui glass wool dan disimpan pada suhu 20° C sampai tahap
analisis.
Identifikasi dan kuantitasi asam amino dilakukan dengan menggunakan
larutan standar 1 mM (Sigma Chemical Co., USA). Mengenai sampel, 250 mL
ekstrak yang dicairkan dicampur dengan 50 mL norleusin standar internal (10 mM)
dan 750 mL asetonitril. Campuran disentrifugasi pada 12.000 rpm dan supernatan
(500 mL) dikeringkan dalam evaporator sentrifugal (perangkap dingin Jouan RCT
90). 15 mL reagen pengering (metanol: natrium asetat 1M: TEA, 2: 2: 1) ditambahkan
ke sampel kering dan campuran dikeringkan kembali. Derivatisasi kemudian
dilakukan penambahan 15 mL larutan fenil iso- tiosianat (PITC) (metanol: air: TEH:
PITC, 7: 1: 1: 1). Larutan disimpan pada suhu kamar selama 20 menit dan
dikeringkan kembali. Sebelum analisis, sampel dan standar dilarutkan dalam 300 mL
larutan reagen pengenceran yang terdiri dari 5 mM dapar natrium fosfat dan 5%
asetonitril (pH 7,4). Derivat PITC dianalisis dengan HPLC fase balik menggunakan
instrumen HPLC Seri 1200 dari Agilent (Palo Alto, CA, USA) dengan detektor diode
array (DAD). Pemisahan asam amino dilakukan dengan menggunakan kolom
PicoTag® (60 Å, 4 mm, 300 mm 3,9 mm) pada laju alir 1 mL / menit, 52° C, dan
deteksi diukur pada 254 nm. Fase geraknya adalah (A) natrium asetat 0,07 M pada pH
6,55 dan asetonitril 2,5% dan (B) 45:40:15 asetonitril: air: metanol. Gradien mulai
dari 0% hingga 3% B selama 13,5 menit, lalu 3,5% hingga 19 menit, 4,5% hingga 21
menit; 33% sampai 40 menit, dan terakhir sampai 40% sampai 50 menit. Selanjutnya,
 kolom dicuci dengan 100% B selama 10 menit. Hasil dinyatakan sebagai mg dari
setiap asam amino per g sampel.

2.11. Analisis Statistika

Hasil dianalisis menggunakan software SPSS v18.0 dan ditampilkan dalam
tabel sebagai mean ± SEM (Standard Error Mean). Analisis varian satu arah
(ANOVA) kemudian dilakukan dan diikuti oleh uji Duncan untuk memperkirakan
signifikansi di antara efek utama menggunakan probabilitas P <0,05. Efek dianalisis
hingga interaksi dua arah. Perbedaan yang signifikan antara cara diidentifikasi dengan
beberapa perbandingan antara tiga kelompok (kontrol, gelatin, gelatin þ HAE) dan
hari penyimpanan (1, 3, 6 dan 8) menggunakan prosedur perbedaan paling tidak
signifikan (LSD).

Hasil
3.1 Penurunan Berat
Penurunan berat badan sampel diukur sebelum dan sesudah pelapisan, dan
selama penyimpanan pada suhu 4ºC. Dengan hasil penurunan berat badan sampel
kontrol (tidak dilapisi) diperkirakan 0,8%, 4% dan 13,8% masing-masing setelah 3, 6
dan 8 hari penyimpanan. Namun, pada sempel yang dilapisi menunjukkan nilai
penurunan berat badan sebesar 0,3%, 0,75% dan 2,6% pada 3, 6 dan 8 hari. Tidak ada
perbedaan yang signifikan dalam mencegah penurunan berat badan antara daging
yang dilapisi gelatin dan gelatin diperkaya dengan HAE pada 50 mg / mL (p <0,05).
Telah dilaporkan secara luas bahwa gelatin kaya akan hidrofilik dan beberapa asam
amino hidrofobik, yang mampu menahan air, sehingga mencegah hilangnya
kelembapan dengan bertindak sebagai pertahanan fisik. Dalam konteks ini, Herring et
al pada tahun 2010 melaporkan kemampuan tinggi lapisan gelatin dalam mengurangi
hilangnya kelembaban dan membuktikan bahwa gelatin dapat mengurangi lapisan
daging babi selama 7 hari penyimpanan dalam lemari es.

3.2 Prubahan pH, aktivitas air dan parameter warna

Pengaruh pelapisan gelatin terhadap parameter pH, aktivitas air dan warna
daging sapi selama masa penyimpanan selama beberapa hari yaitu, pH sampel kontrol
menunjukkan peningkatan yang signifikan setelah 6 dan 8 hari penyimpanan, sempel
dengan lapisan gelatin menjaga pH konstan selama waktu penyimpanan, dan sampel
dengan lapisan gelatin + HAE menunjukkan penurunan pH yang signifikan setelah 8
hari didinginkan. Mengenai Hal ini, peningkatan nilai pH diamati pada kontrol setelah
6 dan 8 hari bisa terjadi karena pembusukan daging serta pembentukan amina dan
NH3 selama produksi asam amino bebas sebagai akibat dari reaksi basa (Karabagias,
Badeka, & Kontominas, 2011).
Aktivitas air merupakan faktor penting untuk mengontrol pertumbuhan
mikroorganisme pada daging yang disimpan, dan itu dapat didefinisikan dengan
jumlah air bebas yang ada dalam produk dan tersedia untuk pertumbuhan bakteri.
Hasil kontrol, daging lapis gelatin, dan daging dilapisi dengan gelatin + HAE tidak
menunjukkan perbedaan yang signifikan selama 8 hari penyimpanan dingin.
Selain itu, perubahan parameter warna sampel daging. Dalam sampel kontrol
dan Gelatin + HAE, nilai lightness (L*) menunjukkan peningkatan yang signifikan
selama pendinginan penyimpanan. Kemerahan daging adalah parameter paling khas
untuk warna perubahan produk daging. Berdasarkan pengamatan visual, warna
sampel daging yang dilapisi dipengaruhi oleh waktu penyimpanan dari merah terang
(segar), merah pucat hingga merah tua selama penyimpanan dingin. Namun, warna
daging yang tidak dilapisi berubah dari merah cerah menjadi coklat tua setelah 8 hari
penyimpanan. Faktanya, pada peningkatan waktu penyimpanan, kemerahan dari
daging control menurun dan nilai secara signifikan lebih rendah dari gelatin dan
gelatin + HAE. Selama 3, 6 dan 8 hari masa penyimpanan, kekuningan daging kontrol
masing-masing sekitar 4,32, 3,63 dan 2,97, sedangkan nilai kekuningan dan saturasi
warna secara signifikan lebih tinggi pada sampel yang dilapisi (gelatin dan gelatin +
HAE). Jadi, pelapisan daging meningkatkan saturasi warna. Selain itu, jelas dari nilai
kemerahan itu adalah penambahan 50 mg / mL HAE dalam gelatin gel memperbaiki
warna daging jika dibandingkan dengan lapisan gelatin. Lapisan gelatin menawarkan
perlindungan warna yang sesuai dengan Villegas, O'Connor, Kerry, dan Buckley
(1999). Jadi, pelapis gelatin menawarkan perlindungan yang sangat baik untuk
menghindari hilangnya kemerahan yang telah ditingkatkan secara signifikan dengan
penambahan HAE. Herring dkk. (2010) menunjukkan bahwa kemerahan pada daging
babi yang dilapisi gelatin kulit babi dengan konsentrasi 10% terlindungi selama 7 hari
penyimpanan dalam lemari es.

3.3 Kualitas bakteri

 Evolusi populasi mikroba pada daging didinginkan selama waktu
penyimpanan diselidiki dengan hasil pada hari pertama, total viable count (TVC)
sekitar 3 (log CFU / g), mungkin karena kondisi higienis yang digunakan selama
pengangkutan, penyembelihan dan manipulasi daging sapi. Selama waktu
penyimpanan, TVC dan jumlah psikotropika (PTC) dari semua sampel meningkat
jangkauannya, tingkat maksimal pada hari ke-8 periode penyimpanan dingin. Daging
tidak dilapisi menunjukkan jumlah mikroba yang lebih tinggi dibandingkan daging
bersalut (p <0,05) dan nilai 6 log CFU/g pada hari ke-8.
Menurut undang-undang Spanyol (Peraturan EC 2073/05, 2005), batas yang
ditetapkan untuk jumlah bakteri adalah 106 CFU/g pada daging. Jadi, umur simpan
sampel kontrol adalah 8 hari penyimpanan dingin. Namun, pelapisan dengan gelatin
menunda dan membatasi pertumbuhan mikroorganisme berkat peran penghalang dari
bio-film protein yang terbentuk di sekitar sampel daging terhadap oksigen difusi dan
proliferasi bakteri. Terlebih lagi, dalam sampel yang diperkaya gelatin + HAE, TVC
berkurang dari 4,43 menjadi 3,14 pada hari 3, dari 5,89 menjadi 5,57 pada hari ke 6
dan dari 6,03 menjadi 5,78 pada hari ke 8 dalam perbandingan. Setelah 6 hari
penyimpanan, daging yang dilapisi gelatin + HAE menunjukkan mikroba terendah
dibandingkan dengan sampel lain. Faktanya, PTC daging dilapisi dengan gelatin +
HAE adalah 4,62 log cfu / g, yang secara signifikan lebih rendah (p <0,05)
dibandingkan dengan kelompok kontrol (5,18 log cfu / g) dan yang dilapisi gelatin gel
(5,21 log cfu / g). Hasil ini masuk sesuai dengan TVC dari semua sampel, dan
diperkaya dengan gel HAE terbukti menghasilkan pengawetan yang lebih baik
daripada daging yang tidak dilapisi setelah 6 hari penyimpanan.
Beberapa fitokimia sebelumnya telah diisolasi dari henna (estrak pacar),
seperti asam galat, lawone dan 1,4-naphthoquinone, yang menawarkan sifat
antimikroba (Ahmad & Beg, 2001; Yang & Lee, 2013). Di sisi lain, Lorenzo dkk.
(2014) melaporkan teh hijau yang tergabung dalam lapisan sintetis mengurangi
pertumbuhan mikroba daging sapi hingga 4 log CFU/g setelah penyimpanan 2
minggu. Di studi ini, penurunan yang signifikan dalam jumlah mikroorganisme
diamati pada sampel yang dilapisi gelatin + HAE dikaitkan dengan efek antibakteri
dari HAE (Jridi et al., 2016). Ini hasil menunjukkan bahwa HAE mungkin
mengandung molekul bakterisida, bertanggung jawab untuk memperpanjang umur
simpan sampel berlapis gelatin + HAE lebih dari 8 hari penyimpanan dingin. Meski
terjadi penurunan mikroba pertumbuhan tidak terlalu tinggi, hasil ini menunjukkan
relevansi penambahan HAE pada lapisan produk daging. Mungkin sebuah
perlindungan dati peningkatan pertumbuhan mikroba dapat dicapai dengan
meningkatkan konsentrasi lapisan HAE. Di samping itu, harus diperhitungkan bahwa
konsentrasi aktif senyawa dalam henna mungkin berbeda menurut varietas, asal, atau
bahkan lingkungan tempat tanaman itu tumbuh seperti semula dijelaskan sebelumnya
terjadi pada tumbuhan lain.