ACARA II MIKROBIA DALAM RUMEN

Tujuan Praktikum Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui penentuan biomassa berdasar kandungan protein sel, Mengentahui penentuan kadar protein mikrobia (metode lawry), menentukan aktivitas enzim CMC-ase, dan mengetahui penentuan NH3 cairan rumen. Tinjuan Pustaka Mikroorganisme dalam rumen mempunyai fungsi memecah karbohidrat kompleks seperti selulosa, hemiselulosa, dengan proses fermentasi menjadi asam-asam lemak rantai pendek melalui aktivitas enzimnya. Hal yang sama, protein dalam pakan dipecah menjadi peptida, asam-asam amino, amonia, dan amine. Mikroorganisme menggunkana subtansi ini kebutuhan perkembangan selnya sendiri. Protein pakan akan diubah menjadi protein bakterial dan protozal sebelum benar-benar digunakan oleh sapi. Ini juga merupakan alasan bahwa urea (NDN)dapat dimanfaatkan sebagai sumber protein oleh ruminansia, yang pada ternak monogastrik tidak bermanfaat karena tidak mempunyai cukup banyak mikrobia yang mampu mensintesis protein. ( Prihadi, 1997). Aktifitas fermentasi mikrobia dalam rumen dapat berlangsung dengan baik apabila kondisi rumen anaerob, temperatur, rumen konstan, pH rumen normal ( 6-7 ) dan adanya pengaturan laju pengosongan rumen sehingga setiap saat rumen berisi pakan dan mikrobia (MC. Donald. Et.al, 1988). Ekositem mikrobia rumen merupakan suatu kondisi yang kompleks dan sangat tergantung dari pakan yang diberikan kondisi rumen bersifat anaerob dengan temperatur yang relatif konstan antara 38 - 42 dan

pH sekitar antara 6,7-6,8 yang dipertahankan oleh adanya sistem saliva yang berfungsi sebagai buffer. ( Van Soest, 1994).

Materi dan Metode Materi Alat. Alat yang digunakan dalam praktikum mikrobia dalam rumen adalah timbanagan, sentrifuge, tabung sentrifuge, penghitungan waktu, ependrof, pemanas, tabung reaksi, spektrofotometer, inkubator, dan refrigerator. Bahan. Bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah cairan rumen, NaOH 1 N, 2,5 ml larutan lawry B, 0,25 ml larutan lawry A enzim, buffer, H20, CMC, aquadest, sodium tugstate , H2SO4, supernatan, campuran phenol, dan hipoklorid. Metode Penetuan Biomassa Mikrobia Berdasar Kandungan Protein Sel Preparasi sampel. 3 ml cairan rumen disentrifuge pada 2500 g selama 10 menit, untuk memisahkan partikel pakan. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam safelock tube (ependrof). Supernatan tersebut disentrifuge pada 10.000 g selama 15 menit. Supernatan dipisahkan untuk penetuan aktivitas dan kadar protein enzim pada acara 2. Endapan digunakan untuk penentuan kadar protein mikrobia. Penetuan kadar protein mikrobia ( metode lowry ) Endapan hasil preparasi diatas, ditambah 1 ml NaOH 1 N, kemudian dipanaskan pada suhu 90 selama 10 menit selanjutnya digunakan sebagai sampel untuk

penetuan protein dengan metode lowry. Tabung reaksi disiapkan dan diisi dengan 1 ml sampel /aquades( Balnko) dan 5 ml larutan lowry B, kemudian divortex dan dibiarkana 10 menit. Ditambahkan 0,5 ml larutan lowry A, divortex dan dibiarkan 30 menit Absorbansi dibaca pada 750 nm . Kadar protein dihitung dengan memasukan hasil pembacaan absorbansi ke dalam persamaan kurva standart berikut : Y = 1,9058X + 0,0412 Y= Absorbansi sampel X= Kadar protein (mg/ml) Kadar Protein ( mg/100ml )

= Penentuan aktivitas CMC-ase Masing-masing tabung diisi sebagai berikut : Tabung Enzim Buffer CMC ML ml 1% ml ES 0,1 0,4 1 E O,1 0,4 S 0,4 1 BL 0,4 -

H2O ml 0,3 1,3 0,4 1,4

Total ML 1,8 1,8 1,8 1,8

Sumber enzim adalah filtrat hasil preparasi sempel pada acara 1. Semua tabung yang telah terisi ( sesuai tabel diatas) diinkubasi pada suhu 38 selama 45 menit. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan campuran 1 ml larutan Sianida Karbonat 0,2 ml Sodium Karbonat dan 2 ml larutan 0,05% Potassium Ferrisianida ( pH 10,6) pada semua tabung setelah diinkubasi> Larutan dihomogenkan menggunkan vortex, lalu dipanaskan pada air mendidih selama 30 menit. Tabung didinginkan dan warna yang terjadi dibaca dengan spektofotometer pada panjang gelombang 420 nm. Perhitungan Absorbansi : NO Tabung Transmitan 1 ES 2 E 3 S 4 BL Perhitungan : Absorbansi unit = Abs ( BL-ES) - (BL-E) (BL-S) Hasil perhitungan absorbansi unit digunakan untuk menghitunh aktivitas CMC-ase berdasar persamaan regresi dibawah : Y= 3,7744X+0,0112 Y=absorbansi X=kadar gula mereduksi

Absorban

Aktivitas enzim (

mol /ml ) =

Perhitungan kadar protein enzim Sampel yang digunakan adalah supernatan hasil preparasi sampel acara 1. Cara penetuan kadar protein enzim seperti pada acara 1 ( metode Lowry). Tabung reaksi disiapkan dan diisi dengan 1 ml sampel/aquades ( blanko) dan 5 ml larutan lowry B, kemudian divortex dan dibiarkan selama 10 menit. Ditambahkan 0,5 ml larutan Lowry A, divortex dan dibiarkan 30 menit. Absorbansi dibaca pada 750 nm. Kadar protein dihitung dengan memasukan hasil pembacaan absorbansi ke dalam persamaan kurva standart berikut : Y = 1,9058X + 0,0412 Y= Absorbansi sampel X= Kadar protein (mg/ml)

Kadar Protein ( mg/100ml ) =

Penentuan NH3 Cairan Rumen Penetuan NH3 Cairan Rumen. 1 ml larutan A ( sodium tungstate) + 2 ml Cairan rumen dicampur 1 ml larutan B ( H2SO4 1 N ) dingin yang disimpan dalam refrigerator kemudian dihomogenkan menggunakan vortex. Sampel ini dapat disimpan selama < 48 jam. Sentrifuge sampel pada 15.000 g selama 10 menit. 20 M1 supernatan sampel + 2,5 ml larutan C ( campuran phenol) secepatnya. Diinkubasi pada 40 selama

30 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar. Spektrofotometer di baca dengan panjang gelombang 630 nm. Y= 0,0028X+0,0129 Y= Absorbansi X=Kadar NH3 ( mg/100ml) Kadar NH3 (mg/100ml)= Xx Faktor pengenceran

Hasil Dan Pembahasan Preparasi sampel. Cairan rumen yang disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, bertujuan untuk mengendapkan partikel pakan. Kemudian supernatan yang dihasilkan, disentrifuge kembali dengan kecepatan 10000 rpm untuk mendapatkan endapan mikrobia. Hasil dari preparasi sampel ini adalah cairan rumen yang telah terbentuk menjadi dua lapisan, yaitu enzim rumen (supernatan), yang digunakan untuk penentuan CMC-ase dan presipitat, yang digunakan untuk penentuan protein mikrobia. Protein Mikrobia. Pada praktikum ini, tabung reaksi yang berisi Presipitat hasil filtasi sampel ditambahkan dengan NaOH yang berfungsi untuk meliliskan dinding sel bakteri, kemudian didihkan pada suhu 90 selama 10 menit, yang bertujuan untuk memecah sel. Selanjutnya larutan dibagi menjadi 2 tabung, yaitu larutan sempel dan blanko sebagai pembanding yang ditambahkan 0,5 ml aquades. Selanjutnya masingmasing tabung ditambahkan larutan Lowry B yang terdiri dari CuSO4, Na2CO3, dan Na-kalpitat, lalu setelah dihomogenkan hasilnya adalah terbentuk reaksi tabung berwarna ungu, hal ini di sebabkan karena ikatan Cu pada CuSO4 berikatan dengan peptida dalam larutan sampel. Pada penambahan larutan lowry A, setelah dihomogenkan terjadi pembentukan warna yang kompleks pada larutan sampel karena reaksi antara protein dengan folin-colcateau, warna tersebut terjadi karena antar Cu alkali dengan dengan protein sama seperti reaksi biuret, dengan terjadinya reaksi phospomolibat oleh Tyrosin dan Tryptophan yang ada pada protein, Selanjutnya hasil reaksi larutan dibaca pada spektometer 750 nm, dan

hasilnya adalah didapatkan absorbansi sebesar 0,978, yang kemudian digunakan untuk mengukur kadar mikrobia dalam rumen yaitu sebesar 1541,44 /ml. Menurut Orskov (1990) Laju jumlah protein mikrobia diperlukan amonia, asam amino, dan mineral seperti P, sulfur, dan kalsium. Penentuan Aktivitas Enzim CMC-ase. Aktivitas enzim ditentukan dengan menghitung gula reduksi yang dibebaskan dari reaksi hidrolisis substrat CMC (Carboxymethyl Cellulose) oleh enzim CMC-ase. Aktivitas enzim ditentukan dengan menghitung gula mereduksi menggunakan reaksi ferrisianida. Enzim Supranatan dari hasil preparasi sempel yang ditambahkan pada tabung ES, E, S, dan BL dengan komposisi Enzim, buffer, CMC-ase, H3O setelah diinkubasi, dan setelah aktivitas enzim dihentikan dengan tambahan larutan sianida, sodium karbonat, dan potasium ferrisianida pada masing-masing tabung reaksi ,pada pembacaan spektometer 420nm didapat hasil penjumlahan berupa absorbansi produk sebesar Y=-0,444 dan hasil perhitungan absorbansi produk digunakan untuk menghitung aktivitas CMC-ase dan penghitungan kadar gula mereduksi yang didapat adalah X= -227,4238. Kadar jumlah gula reduksi yang didapat sebagian besar dipengaruhi oleh jumlah enzim yang diperoleh dari persamaan regeresi absorbansi produk dan Menurut Davidovich et al., (2010) bahwa jumlah protein enzim dipengaruhi oleh suhu, jumlah substrat, konsentrasi enzim, pH, lama inkubasi, dan jenis mikroorganisme. Penentuan NH3 Cairan Rumen. Pada percobaan ini larutan yang direaksikan antara lain larutan A (Sodium tungstate) ditambah cairan rumen (blanko aquades) ditambahkan lagi larutan B ( H2SO4 1 N), lalu dihimogenkan dan disentrifuge 15.000 g selama 15 menit yang hasilnya adalah terdapat endapan yang tidak terikat amonia, Selanjutnya larutan diambil 20 L untuk dijadikan supernatan sempel dan ditambah larutan C (

terdiri dari phenol, Na Nitroprusside, phenol kristal ) ditambah lagi D (Hypochloride, NaOH pekat, Na2HPO4, dan Sodium Hypochloride) dan setelah dicampur dan diinkubasi pada suhu 40 hasilnya adalah larutan

berubah menjadi berwarna biru yang disebabkan reaksi antara amonia dengan sodium fungstate yang disebut reaksi indophenol. Pada praktikum ini didapat juga Absorbansi produk sebesar 0,449 dan kadar gula mereduksi 123,88 mg/100ml. Konsentrasi amonia cairan rumen 134 mg/100ml sedangkan untuk pertumbuhan maksimum dan aktivitas mikrobia diperlukan cairan rumen sebesar 550 mg/100ml cairan rumen (Bondi, 1987). Sedangkan hasil yang diperoleh dalam praktikum tidak sama dengan literature bahkan nilainya sangat besar bila dibandingkan dengan dasar teorinya yaitu sebesar 106,52 mg/ml. Perbedaan ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya amonia, asam amino, dan mineral seperti P, sulfur, dan kalsium (Orskov, 1990).

Kesimpulan Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa faktor-faktor yang mempengaruhi sintesis protein MO adalah ketersediaan prekursor dalam konsentrasi yang cukup dalam rumen, kelarutan dan tingkat degradasi protein pakan sebagai sumber N, ketersediaan energi total hasil fermentasi dalam rumen untuk menunjang pertumbuhan mikro organisme secara maksimal, kecepatan absorbsi amonia dan asam amino, tingkat konsumsi pakan, laju aliran partikel dalam rumen. Dan juga keadaan atau suasana (anaerob) mempengaruhi banyak sedikitnya konsentrasi protein mikrobia dan protein enzim. Semakin anaerob suasana maka semakin banyak mikrobia yang tumbuh seperti dalam keadaan sebenarnya yaitu di rumen, karena jika suasana aerob maka banyak mikrobia anaerob yang mati sehingga menyebabkan konsentrasi protein semakin kecil. Pada Praktikum ini juga didapat hasil kadar protein mikrobia 1541,44 /ml , kadar gula mereduksi dalam rumen X=-227,4238 NH3 dalam rumen sebesar 106,52 /ml. /ml , dan juga kadar

Daftar Pustaka
Davidovich, E. E. Bartley, R. M. Bechtle and A. D. Dayton. 2010. From the Rumen and Passage of Urea and Ammonia from the Ammonia Toxicity in Cattle. III. Absorption of Ammonia Gas Rumen to Duodenum. Bondi. A. A. 1987. Animal Nutrition. John Willey and Sons Publ, New York. Van Soest, P. J. 1994. Nutritional Ecology of The Ruminan. Cornel University, New York. MC Donald, P RA. Edward and J.F.D greeholg. 1988. Animal Nutrition. 4 th ed. English language Book Society. Logman. London. Pp.226-235. Orskov, E. R, and M. Ryle. 1990. Energy Nutrition in Ruminant. Elsevier Applied Science London. Prihadi, sugeng. 1997. Dasar Ilmu Ternak Perah. Fakultas Peternakan. Universitas Gadjah mada.

Van Soest, P. J. 1994. Nutritional Ecology of The Ruminan. Cornel University, New York.

LAMPIRAN

1. Penentuan kadar protein mikrobia Diketahui : absorbansi sampel =Y= 0,365 Perhitungan :
Y = 0,0025 X + 0,00146 0,978 = 0,0025 X + 0,0146 0,978 0,0146 0,9634 X = = =1541,44 / ml 0,0025 0,0025

Jadi kadar protein mikrobia dalam cairan rumen adalah 1541,44 /ml 2. Penentuan aktivitas enzim CMC-ase Diketahui : absorbansi BL = 0,834 ES = 0,073 E = 0,453 S = 0,01 Ditanya : absorbansi produk = Y Kadar gula mereduksi = X Penyelesaian Y= Abs (BL-ES) (BL-E) (BL-S)

= Abs (0,834-0,073) (0,834-0,453) (0,834-0,01) = Abs (-0,444)

Y = 0,002034 X + 0,01858 - 0,444 = 0,002034 X + 0,01858 - 0,444 0,01858 0,46258 X = = = 227,4238 / ml 0,002034 0,002034

Jadi kadar gula mereduksi pada mikrobia rumen adalah 9,62 /ml.

3. Penentuan NH3 cairan rumen Diketahui : Absorbansi = Y=0,449 A Ditanya : kadar NH3 Penyelesaian
Y = 0,0068 X +0,0278 0,449 = 0,0068 X +0,0278 0,449 0,0278 0,4212 = = 61,94 / ml.2 0,0068 0,0068 =123,88mg / 100ml X =

Jadi kadar NH3 dalam mikrobia rumen adalah 123,88 mg/100ml.

LAPORAN PRAKTIKUM ACARA II MIKROBIA DALAM RUMEN

Disusun Oleh: Kelompok VIII

Shendy Archie Puput Indah Ibnu Fajar Aditiya Nugroho Maulina

PT/06225 PT/06258 PT/06301 PT/06302 PT/06414

Asisten : Shifa Latiefa

LABORATORIUM BIOKIMIA NUTRISI BAGIAN NUTRISI DAN MAKANAN TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2013