LBKURCC20
DENGAN PENGENDAPAN AMONIUM SULFAT 80% JENUH
ABSTRACT
ABSTRAK
283
PENDAHULUAN berikatan dengan garam. Semakin
banyak molekul air yang berikatan
Penicillium sp. merupakan fungi dengan ion-ion garam mengakibatkan
yang banyak digunakan pada produksi protein saling berinteraksi, teragregasi
enzim selulase. Fungi ini mampu dan mengendap (salting out). Amonium
menghasilkan enzim endoglukanase, sulfat memiliki daya larut yang sangat
eksoglukanase dan β-glukosidase dalam tinggi, dan garam ini paling banyak
jumlah besar. Pertumbuhan Fungi digunakan untuk fraksinasi protein-
Penicillium dipengaruhi oleh protein. Amonium sulfat yang jenuh
ketersediaan sumber nitrogen dan disiapkan pada suhu ruang dengan
oksigen. menambahkan 767 g pada 1 liter
Enzim selulase dapat akuades, dan ini disebut larutan saturasi
menghidrolisis ikatan β-1,4-glikosida 100%, dan dengan fraksinasi dinyatakan
membentuk glukosa. Selulase kompleks secara relatif terhadap saturasi tersebut
mengandung selobiohidrolase, (Bintang, 2010). Penelitian ini bertujuan
endoglukanase, dan β-glukosidase. Ekso- untuk pemekatan selulase menggunakan
1,4-β-D-glukanase (selobiohidrolase) padatan ammonium sulfat (NH4)2SO4
dapat mendegradasi selulosa dari ujung anhidrat 80% jenuh.
pereduksi dan nonpereduksi untuk
menghasilkan selobiosa dan glukosa. METODE PENELITIAN
Endoglukanase dapat menghidrolisis
selulosa amorf sehingga menghasilkan Bahan hidup : Isolat fungi
rantai polisakarida yang lebih pendek. β- Penicillium sp. LBKURCC20 yang
glukosidase (selobiose) akan merupakan koleksi laboratorium
menghidrolisis polisakarida yang pendek Biokimia, FMIPA, Universitas Riau,
pada selobiosa untuk menghasilkan yang telah diisolasi dari tanah hutan
glukosa monosakarida (Archarya dkk., gambut biosfer Giam Siak Kecil Bukit
2008). Batu, Riau dan dipelihara pada media
Pemekatan enzim dapat Potato Dextroxe Agar dari penelitian
dilakukan dengan pengendapan protein terdahulu.
melalui penambahan garam ammonium
sulfat ((NH4)2SO4). Prinsip pengendapan a. Peremajaan isolat jamur
protein adalah berkurangnya kelarutan Penicillium sp. LBKURCC20 pada
protein dalam larutan karena air diserap media PDA
oleh garam. Penambahan garam
dilakukan dalam konsentrasi tinggi. Isolat jamur Penicillium sp.
Konsentrasi garam yang rendah LBKURCC20 diambil dengan
meningkatkan kelarutan protein karena menggunakan ose secara aseptis dan
ion-ion berinteraksi dengan gugus diinokulasikan ke media PDA. Media
bermuatan pada permukaan protein dan PDA yang telah diinokulasikan isolat
mengganggu dengan kekuatan jamur Penicillium sp. LBKURCC20
elektrostatik yang kuat yang disebut diinkubasi pada suhu ruang selama 20
proses salting in. Penambahan garam hari atau hingga spora hijau tumbuh
dalam konsentrasi tinggi menyebabkan subur.
molekul air yang semula terikat pada
permukaan hidrofobik protein kemudian
284
b. Inokulasi jamur Penicillium sp. protein dianalisis menggunakan metode
LBKURCC20 pada media cair Lowry.
285
dipanaskan dalam penangas air selama HASIL DAN PEMBAHASAN
20 menit. Tambahkan 500 µL reagen
arsenomolibdat, dihomogenkan, dan Pemekatan enzim selulase
diamkan selama 5 menit. Tambahkan 3 bertujuan untuk meningkatkan aktivitas
mL akuades, dihomogenkan, dan dengan cara mengurangi kandungan
diamkan selama 30 menit. Absorbansi senyawa-senyawa lain dari ekstrak kasar
diukur pada λ=540 nm. enzim. Pemekatan enzim menggunakan
Sebagai kontrol, tabung blanko metode penggaraman dengan padatan
diisi dengan 1 mL larutan buffer asetat amonium sulfat anhidrat 80% jenuh.
0,05 M pH 5,5 dan 1 mL larutan Metode ini merupakan salah satu cara
yang sederhana dan murah dan juga
intermediet glukosa kemudian
tidak merusak enzim. Amonium sulfat
ditambahkan 1 mL reagen Nelson- yang dilarutkan dalam air akan
Somogyi, vortex dan panaskan dalam menyebabkan terjadinya proses salting
penangas air selama 20 menit. out sehingga protein akan mengendap.
didinginkan hingga suhu kamar. 1 mL Salting out terjadi akibat kompetisi
reagen arsenomolibdat ditambahkan antara ion-ion dari garam amonium dan
pada tabung blanko, diamkan selama 5 molekul enzim dalam berinteraksi
dengan molekul air. Dengan tingginya
menit. Setelah 5 menit, tambahkan 6 mL
kadar ion, menyebabkan molekul protein
akuades untuk tabung blanko, vortex berinteraksi dengan molekul protein
hingga tercampur sempurna lalu lainnya sehingga membentuk endapan.
didiamkan selama 30 menit. Pengukuran Meskipun mengendap namun tidak
absorbansi dilakukan menggunakan menyebabkan struktur protein dari enzim
spektrofotometer pada panjang rusak dan kehilangan aktivitasnya
gelombang 540 nm dan dilakukan dua apabila dilakukan pada suhu (5-10)0C.
Hasil uji aktivitas dan aktivitas spesifik
kali pengulangan untuk analisis. Satu
enzim selulase Penicillium sp.
unit aktivitas enzim selulase LBKURCC20 menggunakan substrat
didefinisikan sebagai banyaknya enzim CMC ditunjukkan pada Tabel 1 dan
yang melepaskan 1 µmol gula pereduksi substrat avisel pada Tabel 2.
per-menit. Kadar protein ditentukan
dengan metode Lowry (Boyer, 1993).
Tabel 1: Uji aktivitas dan aktivitas spesifik enzim selulase (CMCase) Penicillium sp.
LBKURCC20.
286
Tabel 2: Uji aktivitas dan aktivitas spesifik enzim selulase (aviselase) Penicillium sp.
LBKURCC20.
Tingkat
Jamur Rata-rata
Kelipatan Kadar protein Aktivitas spesifik pemurnian
Penicillium sp. aktivitas enzim
pemekatan (mg/mL) (U/mg protein) aviselase
LBKURCC20 (10-3 U/mL)
(Eksoglukanase)
Ekstrak kasar 0,003 ± 0,0025 1x 0,017745 0,169 ± 0,2137 1
enzim
0,00056 ± 0,0000 0 Tidak Tidak 0
Supernatan
terdeteksi terdeteksi
Enzim 0,03 ± 0,03 10x 0,6616 0,002 ± 0,9164 0,01
selulase pekat
Kelipatan pemekatan enzim LBKURCC20 pada suhu 400C, pH 5,5
selulase ditentukan dengan menghitung dan 96 jam waktu produksi, masing-
peningkatan aktivitas enzim selulase masing adalah sebesar (0,0131 ±
antara ekstrak kasar enzim dan enzim 0,0013) U/mL dan (0,0436 ±
pekat hasil pengendapan. CMC 0,0013) U/mL. Aktivitas CMCase yang
merupakan selulosa koloidal yang diperoleh tidak berbeda jauh dari
berbentuk amorf. Hidrolisis CMC oleh aktivitas CMCase pada penelitian
ekstrak kasar maupun hasil pemekatan sebelumnya. Hasil yang diperoleh pada
ekstrak enzim menunjukkan adanya penelitian ini menunjukkan isolat
aktivitas enzim endoglukanase. Avisel Penicillium sp. LBKURCC20 juga
merupakan selulosa koloidal yang memiliki aktivitas CMCase. Sedangkan
berbentuk mikrokristalin. Hidrolisis Aktivitas aviselase yang diperoleh pada
avisel oleh ekstrak kasar maupun hasil penelitian ini berbeda jauh dari aktivitas
pemekatan ekstrak enzim menunjukkan aviselase pada penelitian sebelumnya.
adanya aktivitas enzim eksoglukanase. Aktivitas enzim CMCase lebih tinggi
Penentuan aktivitas enzim CMCase dan dibandingkan dengan aktivitas
aviselase bertujuan untuk mengetahui aviselase. Perbedaan yang terjadi karena
jenis selulase yang terdapat pada penelitian ini menggunakan CMC dan
ekstrak kasar enzim dan hasil avisel sebagai sumber karbohidrat,
pemekatan ekstrak enzim. sehingga fungi lebih cenderung
Aktivitas CMCase dan aviselase menghasilkan CMCase daripada
ekstrak kasar enzim dan enzim pekat aviselase. Hal ini menunjukkan bahwa
(Tabel 1 dan 2) menunjukkan terjadi selulase Penicillium sp LBKURCC20
peningkatan aktivitas enzim setelah memiliki lebih banyak endoglukanase
pemekatan hingga 70 kali volume yang (CMCase) daripada eksoglukanase
menghasilkan kelipatan pemekatan (aviselase). Sedangkan pada penelitian
sebesar 13,5 kali dan 10 kali. Berarti sebelumnya hanya menggunakan avisel
sebagian besar saat proses pemekatan sebagai sumber karbohidrat sehingga
terjadi denaturasi enzim, ditambah cenderung menghasilkan aktivitas
adanya pengaruh garam yang tersisa aviselase yang tinggi.
pada endapan karena tidak dilakukan Aktivitas spesifik enzim
dialisis. diperoleh dengan membagi aktivitas
Sepryani (2012) melaporkan enzim dengan kadar protein. Penentuan
aktivitas ekstrak kasar enzim CMCase kadar protein dilakukan dengan
dan aviselase Penicillium sp. mengunakan metode Lowry. Kadar
287
protein supernatan tidak dapat setelah pemekatan melalui pengendapan
ditentukan menggunakan metode (NH4)2SO4 80% jenuh, yaitu (0,003 ±
Lowry, karena adanya pengaruh ion 0,0025) U/mL menjadi (0,03 ±
NH4+ pada saat proses pengendapan 0,03) U/mL.
yang dapat menggangu penentuan kadar
protein. Aktivitas spesifik enzim UCAPAN TERIMA KASIH
menunjukkan tingkat pemurnian suatu
enzim, semakin tinggi aktivitas spesifik Penelitian ini didanai oleh skim
suatu enzim, maka semakin tinggi penelitian Fundamental a.n. Titania T.
tingkat pemurnian enzim tersebut. Nugroho sebagai ketua tim peneliti
Aktivitas spesifik CMCase ekstrak dengan Dana Desentralisasi DP2M
kasar enzim adalah sebesar (0,9242 Dirjen Dikti, Kemendikbud, Lembaga
±0,9242) U/mg protein dan enzim Penelitian Univesitas Riau, nomor
selulase pekat sebesar (0,331 ± 0,7226) kontrak 321 NN.19.2/PL/2013, DIPA-
U/mg protein. Aktivitas spesifik 023.04.2.415.92/2013.
aviselase ekstrak kasar enzim adalah
sebesar (0,169 ± 0,2137) U/mg protein DAFTAR PUSTAKA
dan enzim selulase pekat sebesar (0,002
± 0,9164) U/mg protein. Tingkat Acharya, P. B., Acharya, and Modi, H.
pemurnian CMCase dan aviselase yang A. 2008. Optimization for
diperoleh tidak signifikan yaitu 0,35 dan Cellulase Production by
0,01. Aktivitas spesifik menurun setelah Aspergillus niger Using Saw Dust
pemekatan enzim, menunjukkan bahwa as Substrate. African Journal of
tidak terjadi pemurnian yang signifikan Biotechnology. 22: 4147-4152.
dari enzim.
Dalam supernatan aktivitas Bintang, M. 2010. Biokimia Teknik
eksoglukanase sangat rendah dan Penelitian. Erlangga, Jakarta.
aktivitas endoglukanase tidak terdeteksi,
maka kemungkinan eksoglukanase dan Boyer, R. 1993. Modern Experimental
endoglukanase yang mengendap pada Biochemistry. 3rd ed. Benjamin
pemekatan ammonium sulfat sebagian Cummungs, San Francisco.
mengendap dan terdenaturasi atau
terinhibisi oleh sedikit garam yang Sepryani, H. 2012. Isolasi Fungi
tersisa pada proses pelarutan kembali. Aviselitik dan Selulotik Dari
Tanah Hutan Sekunder Area
KESIMPULAN Sundak Cagar Biosfer Giam
Siak Kecil-Bukit Batu, Riau.
Aktivitas CMCase enzim selulase Tesis. FMIPA-UR, Pekanbaru.
Penicillium sp. LBKURCC20
meningkat hingga 13,5 kali setelah
pemekatan melalui pengendapan
padatan (NH4)2SO4 anhidrat 80% jenuh,
yaitu (0,0164 ± 0,0036) U/mL menjadi
(0,219 ± 0,0579) U/mL. Aktivitas
aviselase enzim selulase Penicillium sp.
LBKURCC20 meningkat hingga 10 kali
288