Isolasi dan penyaringan bakteri selulolitik dari tanah dan

optimalisasi produksi selulase

Shilpa Lokhande and Pethe AS

Department of Microbiology, Shri Shivaji College of Arts, Commerce and Science, Akola (M.S.), India –
444003 Email: shilpa.lokhande77@gmail.com | archanapethe14@gmail.com

Abstrak
Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan menyaring bakteri penghasil selulase.
Kultur mikroba diisolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan dari desa-desa yang berbeda
dari sabuk saline dari Distrik Akola dan Buldhana, Maharashtra India. Sebanyak 146 isolat
diisolasi dan diidentifikasi berdasarkan karakterisasi morfologi dan biokimia. Di antara
semua organisme yang diisolasi, terdapat 37 spesies bakteri yang diisolasi. Satu isolat
bakteri selulolitik menunjukkan aktivitas enzim maksimum, dan diidentifikasi sebagai
Bacillus thuringiensis. Kondisi terbaik seperti pH, sumber karbon, suhu dan periode
inkubasi juga diamati untuk organisme penghasil selulase. Karboksimetil selulosa [1,0% (b/
v)] ditemukan sebagai sumber karbon terbaik untuk produksi selulase dan suhu dan pH
media optimal untuk selulase adalah 40° C dan 7 yang menunjukkan aktivitas enzim
maksimum setelah hari ketiga masa inkubasi.
 
Kata kunci: Selulosa, selulase, Bacillus thuringiensis

PENGANTAR
Selulosa biasanya terdegradasi oleh enzim yang disebut selulase. Enzim ini diproduksi oleh
beberapa mikroorganisme, umumnya oleh bakteri dan jamur (Immanuel et al., 2006).
Selulosa adalah polisakarida yang paling berlimpah dan sumber karbon non fosil yang
terbarukan di bumi. (Coughlin 1990). Mikroorganisme selulolitik menghasilkan susunan
selulase yang bertindak secara sinergis untuk mendegradasi selulosa (Lynd et al., 2002).
Degradasi selulosa menjadi glukosa dipengaruhi oleh aksi kerja sama dari sel-sel
endocellulas, exocellulases dan βglucosidases (Bhat 1997). Selulase adalah sistem enzim
kompleks yang menghidrolisis ikatan β-1, 4 glikosidik dalam selulosa untuk melepaskan
unit glukosa (Nishida et al., 2007). Enzim selulosa yang dibutuhkan untuk hidrolisis
selulosa termasuk endoglucase (CMCase), exoglucanase (FPase) dan β-glukosidase
(cellobiase) (Matsui et al., 2000).
Para peneliti memiliki ketertarikan yang kuat pada selulase karena penggunaannya
di berbagai industri, termasuk pengolahan pati, fermentasi alkohol biji-bijian, pembuatan
bir dan anggur, ekstraksi jus buah dan sayuran, tekstil, deterjen, pakan ternak, pulp dan
kertas, serta dalam pengembangan penelitian (Gao et al., 2008 dan Zhou et al., 2008). 
Untuk memahami mekanisme degradasi selulosa oleh selulase, perlu untuk
mengisolasi, memurnikan dan mengkarakterisasi enzim ini. Oleh karena itu, penelitian ini
dirancang untuk mengisolasi dan Menyaring organisme Penghasil Selulase dari Tanah.

MATERIAL DAN METODE 

Isolasi organisme
Bakteri diisolasi dari sampel tanah yang dikumpulkan dari desa-desa yang berbeda
di saline Akola dan Buldhana, Maharashtra, India. Metode pengenceran bertahap
digunakan untuk mengisolasi bakteri selulolitik. Media yang digunakan untuk bakteri
selulolitik mengandung 1,0% pepton, 1,0% karboksimetilselulosa (CMC), 0,2% K2HPO4,
1% agar, 0,03% MgSO4,7H2O, 0,25% (NH4) 2SO4 dan pH 7. Media ini kemudian
diinkubasi selama 48 jam pada saat 30° C.

Penapisan Primer untuk Aktivitas Selulolitik

Mikroba yang terisolasi ditanam pada media garam basal yang dilengkapi dengan 1%
karboksi metilselulosa (Hankin dan Anagnostaksis, 1975). Kultur diinokulasi di pusat
dengan jumlah yang hampir sama dan diinkubasi pada 30 ± 2 ° C sampai terlihat adanya
pertumbuhan yang signifikan. (Gautam et al., 2012). Cawan petri diisi dengan larutan
merah Kongo (0,1% b / v) selama 15 menit. Larutan merah Kongo dibuang, dan petri dicuci
dengan larutan NaCl 1M yang kemudian dibiarkan selama 15-20 menit. Pembentukan zona
bening diamati di sekitar koloni ketika enzim telah memanfaatkan selulosa. (Shaikh et al.,
2013) Zona bening di sekitar koloni diukur untuk mengetahui produsen selulase tertinggi.
(Gautam et al., 2012).

Identifikasi mikroba selulolitik

Identifikasi mikroba selulolitik dilakukan dengan menggunakan metode yang dijelaskan
oleh Cowen dan Steel (1993) dan Cullimore (2000) yang didasarkan pada karakteristik
morfologi dan bio-kimia.

Penapisan Sekunder dan Pengembangan Inokulum

Kultur murni dari isolat bakteri terpilih diinokulasi dalam media kaldu yang mengandung
media garam basal yang mengandung 1% Carboxy methylcellulose (CMC) sebagai sumber
karbon tunggal dan diinkubasi pada suhu 28 ± 2 ° C selama 4-8 hari untuk jamur dan 37 ° C
selama 2-4 hari untuk bakteri. Setelah 24 jam periode fermentasi, sel-sel vegetatif hasil
fermentasi ini digunakan sebagai sumber inokulum.

Proses fermentasi terendam

Spesies selulolitik teridentifikasi disaring untuk produksi enzim selulase dalam proses
fermentasi terendam, memiliki komposisi media garam basal yang mengandung Carboxy
methylcellulose (CMC) 1% dan disterilkan pada 121⁰C selama 15 menit. Fermentasi
dilakukan dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang masing-masing berisi 100 ml media
produksi steril dan diinokulasi dengan 5% inokulum standar (mengandung 2-3,5x106 sel/
ml). Labu diinkubasi pada suhu 37° C untuk bakteri pada rotari dengan kecepatan 150 RPM
selama 72 jam. (Shaikh et al., 2013)
 
Persiapan Enzim kasar
Setelah penghentian periode fermentasi, kaldu yang difermentasi disentrifugasi pada 1600
RPM selama 20 menit pada suhu 4° C untuk menghilangkan bahan yang tidak diinginkan.
Supernanant yang jelas diperoleh setelah sentrifugasi berperan sebagai sumber enzim kasar
dari bakteri (Shaikh et al., 2013).
 
Estimasi Aktivitas Selulase dengan Metode DNS
B Strain bakteri yang dipilih diinokulasi dalam media produksi enzim yang mengandung
komposisi berikut: 20g Karboksimetil selulosa, ekstrak ragi 5g 0,2g MgSO4,7H2O, 5g
K2HPO4, 10g NaCl dalam 1000ml pada pH7 dan diinkubasi selama semalam pada suhu 37
° C. C dalam shaker. Setelah inkubasi, biakan disentrifugasi dan supernatan digunakan
untuk uji selulase.

Uji Enzim
Aktivitas kertas Filter (FPase) untuk aktivitas total selulase dalam filtrat kultur ditentukan
dengan metode standar (Hankin et al., 1977). Aliquot dari filtrat kultur yang diencerkan
dengan tepat sebagai sumber enzim ditambahkan ke kertas saring Whatman's no. 1 (1 × 6
cm; 50 mg) yang direndam dalam satu mililiter 0,05 M Sodium sitrat buffer pH 5,0. Setelah
diinkubasi pada suhu 50° C selama 1 jam, gula reduksi yang dilepaskan diperkirakan
dengan metode dinitrosalicylic acid (DNS) (Miller 1959). Satu unit aktivitas kertas saring
(FPU) didefinisikan sebagai jumlah enzim yang melepaskan 1 μ mol gula reduksi dari
kertas saring per ml per menit. Aktivitas endoglukanase (CMCase) diukur menggunakan
campuran reaksi yang mengandung 1% karboksimetil selulosa (CMC) sebanyak 1mL
dalam 0,5M sitrat asetat buffer (pH 5.0) dan alikuot dari filtrat yang diencerkan. Campuran
reaksi diinkubasi pada suhu 50° C selama 1 jam, dan gula reduksi yang dihasilkan
ditentukan dengan metode DNS. Aktivitas β-glukosidase diuji dengan metode (Pointing
1999). Satu unit (IU) aktivitas endoglukanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
melepaskan 1 μ mol gula reduksi per menit.
 
Optimalisasi Kondisi Kultur untuk Produksi Enzim
Pengaruh Periode Inkubasi pada Produksi Enzim
Periode fermentasi merupakan parameter penting untuk produksi enzim oleh Bacillus
thuringiensis. Dalam studi ini, percobaan fermentasi dilakukan hingga 7 hari dan tingkat
produksi diukur pada interval 24 jam.
 
Pengaruh Suhu terhadap Produksi Enzim
Untuk menentukan suhu efektif untuk produksi selulase oleh fermentasi Bacillus
thuringiensis dilakukan pada interval 10° C dalam kisaran suhu 20° C hingga 80° C.
 
Pengaruh pH pada Produksi Enzim
Untuk menentukan pH optimal, Bacillus thuringiensis diolah dalam labu 150 mL yang
berisi 50 mL media yang dioptimalkan dengan kisaran pH yang berbeda dari 3,0 hingga
8,0. pH medium disesuaikan dengan menggunakan 1N HCl atau 1N NaOH. Labu disimpan
di panggung stasioner pada 37 ° C selama 5 hari budidaya. 

Pengaruh Sumber Karbon pada Produksi Enzim

Efek dari berbagai senyawa karbon yaitu, selulosa, CMC, dekstrosa, laktosa, sukrosa,
digunakan dipelajari dari selulosa yang dihasilkan. Kaldu didistribusikan ke dalam labu
yang berbeda dan 0,5 hingga 2,5% dari masing-masing sumber karbon kemudian
ditambahkan sebelum inokulasi strain dan setelah kultur inokulasi, labu diinkubasi selama 5
hari pada suhu 40 ° C.
 
HASIL DAN DISKUSI
Penapisan bakteri untuk Aktivitas Selulase
Penapisan bakteri untuk aktivitas selulase dilakukan oleh hidrolisis substrat yang tergabung
dalam media garam basal. Setelah masa inkubasi, aktivitas enzim dideteksi oleh munculnya
zona di sekitar koloni bakteri. Bacillus thuringiensis menunjukkan zona tertinggi di sekitar
koloni, yang digunakan untuk studi lebih lanjut.

Optimalisasi Kondisi Kultur untuk Produksi Enzim

Pengaruh Suhu terhadap Produksi Enzim
Pengaruh suhu pada aktivitas selulase ditentukan dengan menginkubasi labu pada kisaran
suhu 20, 30, 40, 50, 60, 70, C. Hasil tes yang dilakukan pada nilai suhu yang berbeda
menunjukkan bahwa suhu optimal untuk exoglucanase (2,09 IU / mL) dan aktivitas
endoglucanase (1,86 IU / mL) yang diproduksi oleh B. thuringiensis adalah 40° C (Gambar
1), sedangkan suhu optimal untuk aktivitas β-glukosidase (1,95 IU / mL). Pada suhu tinggi
(di atas 60° C), hasilnya menunjukkan bahwa aktivitas enzim menurun ketika suhu
meningkat di atas 65° C. Ray et al., (2007) melaporkan bahwa hasil selulase minimum
diamati ketika fermentasi dilakukan pada suhu 45° C; Immanuel et al., (2006) mencatat
aktivitas endoglukanase maksimum oleh Cellulomonas, Bacillus, dan Micrococcus sp.
terjadi pada suhu 40 ° C dan pH netral.

 
Pengaruh pH pada Produksi Enzim
Ada pengaruh kuat pH awal medium terhadap produksi enzim. Untuk mengevaluasi efek
nilai pH dalam substrat pada sintesis selulase, nilai pH disesuaikan dengan penambahan
HCl atau NaOH ke 3.0, 4.0, 5.0, 7.0 dan 8.0. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 2
menunjukkan bahwa produksi exoglucanase (1,92I U / mL), endoglucanase (1,86IU / mL),
dan β-glukosidase (1,96 IU / mL) oleh B. thuringiensis ditemukan pada 7 pH. Aktivitas
enzim secara bertahap meningkat ketika meningkatkan pH hingga optimal diikuti dengan
aktivitas penuh bertahap. Pengaruh pH pada produksi selulase oleh bakteri ini mendukung
temuan Kim et al., (2009). Bacillus subsp subtilis A-54 memiliki pH optimum 6,5 dan
stabil dalam kisaran pH 6,5 - 8. Menurut penelitian sebelumnya, selulase aktif pada kisaran
pH 6,0 hingga 7,0 dari A. niger (Akiba et al., 1995), 5.0 hingga 7.0 dari Lysobacter sp.
(Ogura et al., 2006)., Dan 5.0 hingga 6.5 dari strain Bacillus (Mawadza et al., 2000).
Pengaruh Masa Inkubasi terhadap Produksi Enzim
B. thuringiensis diinokulasi ke dalam media garam basal dalam labu berbentuk kerucut 150
mL dan diinkubasi pada suhu 40° C selama 7 hari. Aktivitas selulase diukur secara berkala.
Namun, hasil maksimum dari aktivitas exoglucanase (1,41 IU / mL) dan endoglucanase
(1,40 IU / mL) diperoleh setelah 4 hari. Aktivitas maksimum β-glukosidase (1,45 IU / mL)
ditunjukkan setelah inkubasi 4 hari (Gambar 3). Masa inkubasi secara langsung berkaitan
dengan produksi enzim dan metabolisme lainnya hingga batas tertentu. Periode inkubasi
untuk mencapai aktivitas selulase puncak oleh B. thuringiensis terjadi setelah 4 hari, yang
cocok untuk sudut pandang komersial (Kang et al., 2004). Ini mungkin karena menipisnya
nutrisi dalam media yang menekankan fisiologi jamur yang mengakibatkan inaktivasi
sekresi enzim (Nochur et al., 1993).
Pengaruh Sumber Karbon pada Produksi Enzim
Sumber karbon memainkan peran penting dalam metabolisme sel dan sintesis selulase.
Sumber karbon yang diuji untuk produksi enzim selulase oleh B. thurigiensis adalah
selulosa, karboksimetil selulosa, Dekstrosa, Laktosa, dan sukrosa mulai dari 0,5 hingga
2,5% (b / v). CMC ditemukan menjadi sumber karbon terbaik untuk produksi enzim oleh
B. thuringiensis seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Namun, produksi maksimum
exoglucanase (2,11 IU / mL), endoglucanase (2,02 IU / mL), dan βglucosidase (2,08 IU /
mL) diperoleh dalam kultur yang mengandung 1,0% carboxy methyl cellulose. Di antara
berbagai sumber karbon yang digunakan, CMC adalah sumber karbon terbaik kedua (1,0%)
untuk produksi selulase oleh B. thuringiensis diikuti oleh dekstrosa, selulosa, laktosa dan
sukrosa (Tabel 1). Produksi selulase meningkat dengan peningkatan konsentrasi gula awal
dari 1,0 menjadi 1,5% sementara peningkatan lebih lanjut dalam konsentrasi gula sedikit
mengurangi hasil. Pemanfaatan CMC sebagai sumber karbon adalah yang terbaik untuk
produksi selulase seperti yang dilaporkan oleh Das et al., (2010).
Tabel 1: Pengaruh sumber karbon pada produksi selulase oleh Bacillus thuringiensis (ABS 125 A)
Conc. % 0.5 1.0 1.5 2 2.5
1 0.61 1.91 1.50 0.89 0.55
selulosa 2 0.49 1.90 1.41 0.86 0.45
3 0.41 1.85 1.39 0.81 0.49
1 0.71 2.11 1.81 0.99 0.70
Carboxy Methyl 2 0.69 2.02 1.71 0.97 0.62

Cellulose 3 0.67 2.08 1.76 0.81 0.66

1 0.72 1.97 1.61 1.25 0.86
Dekstrosa 2 0.68 1.89 1.56 1.11 0.71
3 0.63 1.90 1.45 1.18 0.69
1 0.41 1.83 1.51 1.11 0.71
Laktosa 2 0.35 1.71 1.45 1.02 0.69
3 0.34 1.63 1.46 1.09 0.65
1 0.55 1.51 1.21 0.88 0.51
Sukrosa 2 0.41 1.40 1.22 0.86 0.43
3 0.40 1.49 1.22 0.76 0.42
1) Exoglucanase, 2) Endoglucanase, 3) β-glucosidase
 
KESIMPULAN
Dalam penelitian ini, pembiakan B. thurigiensis terbukti menjadi sumber yang sangat baik
untuk produksi enzim. Bakteri penghasil selulase ini yang akan membantu dalam produksi
selulase yang secara industri sangat penting dan selanjutnya digunakan untuk biodegradasi
Limbah Padat Kota. Saline belt di wilayah Vidarbha adalah sumber bakteri selulase
berpotensi tinggi yang berguna dalam berbagai bidang seperti industri Farmasi dan industri
Pertanian.