Trisnawati

P07120116009
D3 Keperawatan Reg A

Enzim Beta-Galaktosidase

Enzim ini merupakan salah satu enzim hidrolase yang termasuk dalam operon ara.
Enzim β-galaktosidase memiliki fungsi untuk mengkatalisis rekasi perubahan galaktosida
menjadi galaktosa Enzim β-galaktosidase merupakan enzim yang dapat mengubah laktosa menjadi glukosa
dan galaktosa. Berdasarkan uji kualitatif yang telah dilakukan oleh Suprapti menyatakan bahwa isolat bakteri
termofilik sumber air panas Gedong Songo berpotensi menghasilkan enzim β-galaktosidase. Penelitian ini
bertujuan untuk memperoleh enzim β-galaktosidase dari isolat bakteri termofilik sumber air panas Gedong Songo,
memperoleh karakter enzim dan menentukan aktivitas spesifik enzim β-galaktosidase pada kondisi optimumnya.

Isolasi bakteri menggunakan media ½ Luria Berthani (½ LB). Jenis bakteri diidentifikasi dengan metode
pewarnaan Gram. Enzim β-galaktosidase diproduksi pada media ½ LB selama 6 jam dengan menggunakan laktosa
sebagai penginduksi. Enzim β-galaktosidase diisolasi dengan metode ekstraksi, fraksinasi amonium sulfat
bertingkat dan dialisis. Uji aktivitas enzim β-galaktosidase dilakukan dengan menggunakan ONPG sebagai
substratnya dan kadar protein diukur dengan menggunakan metode Lowry. Karakterisasi enzim meliputi pH, suhu
dan waktu inkubasi optimum dari enzim β-galaktosidase yang diperoleh. Isolat bakteri termofilik sumber air panas
Gedong Songo memiliki sifat gram negatif dan berbentuk batang. Hasil karakterisasi menunjukkan bahwa kondisi
optimum enzim β-galaktosidase isolat bakteri termofilik sumber air panas Gedong Songo dengan substrat ONPG
adalah pada suhu 63 oC, pH 6,2 dan waktu inkubasi 30 menit. Aktivitas spesifik tertinggi pada kondisi optimum
tersebut didapatkan pada F4 (60-80 %) yaitu 44,145 Unit/mg protein.

1. Klasifikasi Enzim β-galaktosidase

Enzim β-galaktosidase merupakan enzim yang memiliki kode enzim 3.2.1.23. Angka 3
menunjukkan kelas utama enzim β-galaktosidase yang termasuk kelas utama hydrolase. Enzim
ini mengkatalisis pembelahan ikatan antara karbon dan beberapa atom lain dengan adanya
penambahan air. Reaksi secara umum termasuk kedalam pemutusan hidrolitik ikatan C-O, C-
N, O-P, dan C-S. Angka 3.2 menunjukkan sub kelas enzim, dimana β-galaktosidase termasuk
ke dalam sub kelas glycosylases. Angka 3.2.1 menunjukan enzim ini termasuk sub sub kelas
Glycosidases yang mana enzim ini dapat menghidrolisis ikatan O dan senyawa glycosyl.

2. Isolasi dan Purifikasi Enzim β-galaktosidase

Enzim ini terdapat pada hewan, tumbuhan, fungi, dan mikroorganisme. Pada bakteri dan
khamir, β-galaktosidase bersifat intraseluler sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler.
Bakteri asam laktat (BAL) menghasilkan β- galaktosidase yang mampu menurunkan kadar
laktosa dalam susu. Lactobacillus bulgaricus merupakan salah satu contoh BAL. Lactobacillus
bulgaricus mampu mengurai 50-60% laktosa secara intraseluler. Kemampuan β-galaktosidase
dalam mencerna laktosa akan meningkat apabila dilakukan pemurnian. Pemurnian enzim
merupakan tahapan pemisahan enzim target dengan protein lain. Pemurnian enzim meliputi
pengendapan oleh garam atau pelarut organik, dialisis, dan kromatografi. Aktivitas spesifik β-
galaktosidase yang tinggi menggambarkan kemampuan enzim yang tinggi dalam
menghidrolisis laktosa. β-galaktosidase dari Lactobacillus bulgaricus meningkat aktivitas
spesifiknya menjadi 62.80 U/mg setelah dilakukan pemurnian. Kemurniannya meningkat 1.47
kali (Mozumder et al 2012). Pemurnian enzim membutuhkan biaya yang tidak sedikit dan
menghasilkan volume enzim yang sangat sedikit. Pemurnian parsial dapat dilakukan untuk
mengatasi masalah tersebut. Tahapan pemurnian parsial akan menghilangkan satu atau
beberapa langkah pemurnian enzim. Hal ini dapat dilakukan apabila aktivitas awal enzim
tinggi. Penelitian tersebut mendasari karakterisasi β-galaktosidsase pada isolat bakteri asam
laktat strain B134.

Prosedur yang dilakukan sebagai berikut :

1) Penyiapan media tumbuh isolat BAL strain B134

Bahan-bahan untuk membuat media MRS modifikasi dan 2 g CaCO3 dilarutkan dalam
200 mL akuades. Nilai pHnya diatur hingga 7.0. Selanjutnya, media dipanaskan dalam
microwave sampai mendidih lalu ditambahkan 0.2 mL tween 80. Media agar MRS modifikasi
di autoklaf pada 121ºC selama 15 menit. Setelah itu, media dituang ke cawan petri.

2) Peremajaan isolat BAL strain B134

Sebanyak 1 ose isolat BAL strain B134 dipindahkan ke cawan petri berisi MRS
modifikasi dengan metode cawan gores. Kemudian, cawan petri diinkubasi dalam inkubator
bersuhu 37ºC selama 24 jam. Kemudian, 1 ose bakteri diambil dan diremajakan kembali dalam
agar miring selama 24 jam untuk dijadikan stok. Stok pada media agar miring ini menjadi
biakan yang akan digunakan untuk total bakteri dan produksi awal β-galaktosidase.

3) Total Bakteri per mL Sel

Sebanyak 0.1 mL bakteri dimasukkan dalam tabung berisi 0.9 mL media MRS modifikasi
cair (merupakan pengenceran 10-4). Pengenceran dilakukan secara berseri hingga 10-7.
Masing-masing pengenceran diambil 100 µL dan disebar menggunakan batang kaca penyebar
pada media agar MRS modifikasi dalam cawan petri. Setelah itu, cawan petri diinkubasi pada
37ºC selama 24 jam. Koloni yang tumbuh pada masing-masing pengenceran dihitung.

4) Produksi Awal
Sebanyak 1 ose biakan bakteri dari stok agar miring dipindahkan ke dalam 200 mL MRS
modifikasi cair. Kemudian, media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Sel dipanen dengan
cara sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit. Pelet yang
diperoleh dicuci sebanyak 2 kali dengan buffer PO4 0.05 M pH 6.5 (1 g/5 mL). Pelet hasil
pencucian buffer yang kedua ditambahkan buffer PO4 0.05 M pH 6.5 dan glass bead. Suspensi
sel divorteks selama 5 menit. Suspensi sel disentrifus kembali pada kecepatan 9.500 rpm pada
suhu 4ºC selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan β-galaktosidase kasar.
Volume enzim yang diperoleh diukur kemudian uji aktivitas dan uji kadar protein dilakukan
untuk mengetahui aktivitas spesifik awal.

5) Optimasi Pertumbuhan
Penentuan Konsentrasi Inokulum. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS
modifikasi cair dengan pH 7. Variasi inokulum bakteri yang digunakan adalah 1%, 2%, dan
5%. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji
aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan inokulum optimum Isolat BAL strain
B134.
Penentuan pH Media. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS modifikasi
cair dengan inokulum hasil optimasi. Variasi pH media yang digunakan adalah 5, 6, 7, dan 8.
Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas spesifik tertinggi berdasarkan uji
aktivitas β-galaktosidase dan kadar protein menunjukkan pH media optimum isolat BAL strain
B134.
Penentuan pengaruh kadar laktosa. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS
modifikasi cair dengan inokulum dan media hasil optimasi. Variasi kadar laktosa yang
digunakan adalah 1%, 2%, dan 3%. Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas
spesifik tertinggi berdasarkan uji aktivitas β- galaktosidase dan kadar protein menunjukkan
kadar laktosa optimum isolat BAL strain B134.
Penentuan waktu pertumbuhan. Bakteri ditumbuhkan dalam 15 mL media MRS
modifikasi cair dengan inokulum bakteri, pH media, dan kadar laktosa hasil optimasi. Variasi
waktu inkubasi yang digunakan adalah 0, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, dan 72 jam.
Media diinkubasi pada 37ºC selama 48 jam. Aktivitas tertinggi berdasarkan uji aktivitas β-
galaktosidase dan kadar protein menunjukkan waktu inkubasi optimum isolat BAL strain B134.
6) Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997)
Inokulum isolat BAL strain B134 diambil sebanyak inokulum hasil optimasi dengan
kerapatan optik 0.7 yang diinokulasikan dalam 2.400 mL media MRS modifikasi cair steril
dan diinkubasi pada suhu 37ºC. Setelah inkubasi selama waktu pertumbuhan optimum, sel
dipanen. Media berisi bakteri yang telah dipanen kemudian disentrifus selama 15 menit
dengan kecepatan 9500 rpm pada suhu 4ºC. Pelet yang dihasilkan kemudian dicuci dengan
buffer fosfat 0.05 M pH 6.5 sebanyak dua kali. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan
dengan buffer fosfat 0.05 M pH 6.5. Kemudian, pemecahan sel dilakukan dengan sonikator
pada 50 kHz selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang dihasilkan merupakan ekstrak
kasar β-galaktosidase.

7) Pengendapan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1987)

Sebanyak 10 mL β-galaktosidase kasar diendapkan dalam amonium sulfat. Penambahan
amonium sulfat dilakukan secara bertahap. Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan yaitu
0-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, dan 60-70%. Larutan kemudian diaduk
dengan magnetic stirrer secara perlahan selama 20 menit kemudian diinkubasi dalam cool
room selama 1 jam. Setelah 1 jam, larutan disentrifus dengan kecepatan 9.500 rpm selama 15
menit pada suhu 4ºC. Pelet yang diperoleh kemudian dilarutkan dalam 1 mL buffer PO4 0.05
M pH 6.5. Kejenuhan amonium sulfat yang optimum akan ditunjukkan oleh aktivitas spesifik
yang tinggi.

8) Pemurnian dengan Dialisis

Tabung dialisis diisi 2 mL β-galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat. Tabung
kemudian direndam dalam 2 liter buffer PO4 0.01 M pH 6.5 yang diletakkan diatas stirer dan
disimpan dalam cool room bersuhu 4ºC selama 15 jam.

9) Uji Aktivitas β-Galaktosidase (modifikasi Liu et al. 2009)

Pengukuran Sampel. Uji aktivitas β-galaktosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL
buffer PO4 0.1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu diinkubasi
pada suhu 37ºC selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl o-nitrofenil-β-D-galaktosida
(oNPGal) 2 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Pada menit ke-5
ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis dengan
mengukur absorban pada λ=420 nm. Pengukuran Kurva Standar. Berbagai konsentrasi oNP
dari 0-2.5 mM yang dilarutkan dalam buffer PO4 0.01 M pH 7. Sebanyak 1 mL buffer PO4 0.1
M pH 7 dan 100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 200
µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 5 menit. Selanjutnya campuran
ditambahkan 1 mL Na2CO3 1 M. Larutan di vortex dan intensitas warna kuning yang
terbentuk diukur absorbansinya pada λ=420 nm. Hasil pembacaan aktivitas β-galaktosidase
dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari
substrat oNPGal per menit pada kondisi percobaan.
Enzim kasar memiliki aktivitas spesifik sebesar 14.638 U/mg dengan rendemen sebesar
100%. Pengendapan amonium sulfat dioptimasi secara bertingkat sehingga diperoleh fraksi
dengan aktivitas tertinggi adalah fraksi 40- 50% dengan aktivitas spesifik sebesar 18.656 U/mg.
β-galaktosidase hasil pengendapan amonium sulfat 50% jenuh memiliki aktivitas spesifik
sebesar 28.170 U/mg dengan rendemen sebesar 19.576%. Kemurnian β-galaktosidase setelah
pengendapan dengan amonium sulfat 50% jenuh sebesar 1.924 kali. β- galaktosidase setelah
perlakuan dialisis memiliki aktivitas spesifik sebesar 45.828 U/mg dengan rendemen sebesar
3.206%. Kemurnian setelah dialisis adalah 3.131 kali.

3. Karakterisasi Enzim β-galaktosidase

1) Pengaruh Suhu
Kerja β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu dan pH. Gambar 1 menunjukkan aktivitas
β-galaktosidase dipengaruhi oleh suhu. Aktivitas β-galaktosidase mengalami peningkatan
seiring naiknya suhu karena energi kinetik yang dihasilkan enzim semakin meningkat. Gerak
vibrasi, translasi, serta rotasi enzim semakin cepat. Peningkatan gerak enzim meningkatkan
terjadinya tumbukan antara enzim dengan substrat. Sebaliknya, suhu tinggi menyebabkan
enzim mengalami perubahan konformasi sisi aktif sehingga aktivitasnya mengalami penurunan
(Hames dan Hooper 2000).

Perubahan konformasi tersebut menyebabkan rusaknya interaksi non kovalen (ikatan

hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik, dan interaksi elektrostatik) yang menjaga
strutur 3D enzim. Akibatnya enzim mengalami denaturasi yang merubah struktur lipatan
enzim. Stuktur enzim akan terbuka dibagian permukaan sehingga sisi aktifnya berubah dan
aktivitas enzim mengalami penurunan (Hames dan Hooper 2000).

Aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi suhu. Pada suhu 25°C dan 45°C mengalami
peningkatan aktivitas, namun pada suhu 50-55 °C
 Organisme yang berbeda tentunya mengahsilkan enzim β-galaktosidase dengan
karakteristik yang berbeda. Perbedaan organisme sumber enzim mempengaruhi suhu optimum
enzim tersebut.

2) Pengaruh pH

Aktivitas β-galaktosidase dipengaruhi oleh pH. Peningkatan aktivitas β-galaktosidase

sebelum mencapai aktivitas optimum disebabkan adanya interaksi antara H+ dari lingkungan
dengan residu asam amino yang terletak pada sisi aktif enzim. Interaksi tersebut menyebabkan
peningkatan keadaan ionisasi sisi aktif enzim. Hal ini menyebabkan sifat katalitik enzim untuk
mengikat substrat meningkat. Ketika mencapai pH optimum, keadaan ionisasi berada pada
keadaan yang tepat sehingga aktivitas enzim mencapai nilai tertinggi. Aktivitas enzim pada pH
yang basa mengalami penurunan karena interaksi antara OH- dari lingkungan dengan residu
asam amino akan menurunkan sifat katalitik enzim dan menyebabkan enzim terdenaturasi
(Nelson dan Cox 2008).

Enzim β-galaktosidase mengalami peningkatan aktivitas pada pH 4,5 hingga 6,

kemudian mengalami penurunan pada pH 6,5 hingga 8,5. Aktivitas tertinggi enzim ini pada pH
6 dengan nilai aktivitas sebesar 19,814 U/mL. Organisme yang berbeda tentunya
mengahsilkan enzim β-galaktosidase dengan karakteristik yang berbeda. Perbedaan organisme
sumber enzim mempengaruhi pH optimum enzim tersebut.

3) Pengaruh Logam

Enzim membutuhkan koenzim dan aktivator untuk meningkatkan sifat katalitiknya.

Ion logam merupakan aktivator yang dibutuhkan enzim untuk mengaktivasi kompleks
substrat-enzim (Bintang 2010). Ion logam akan mengikat substrat pada sisi pemotongan. Ion
logam juga dapat menstabilkan konformasi aktif enzim (Baehaki et al. 2008).
Peningkatan aktivitas enzim terjadi karena ion logam menjadi bagian integral dari sisi aktif
enzim, merubah konstanta keseimbangan reaksi enzimatis, merubah muatan listrik,
menghambat ion inhibitor, dan menukar ion yang kurang efektif pada sisi aktif enzim atau
substrat (Richardson dan Hyslop 1985). Natarajan et al (2012) menunjukkan bahwa Mg2+dan
Mn2+ meningkatkan aktivitas β-galaktosidase dari Bacillus sp. Penurunan aktivitas enzim
terjadi karena ion logam bertindak sebagai inhibitor. Kekuatan ion logam akan mempengaruhi
konformasi dari enzim. Ion Cu2+ dan Hg2+ bertindak sebagai inhibitor irreversibel yang
membentuk ikatan kovalen dengan gugus prostetik di sisi aktif enzim
(Bintang 2010).

4. Mekanisme Reaksi Enzim β-galaktosidase

Enzim β-galaktosidase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis β-galaktosida
seperti laktosa menjadi galaktosa dan glukosa. Jika substratnya adalah laktosa, maka enzim ini
disebut enzim laktase. Hidrolisis laktosa dilakukan oleh beta galaktosidase dilakukan oleh
gugus Glu-1749 yang berperan dalam mekanisme. Glu-1749 berperan sebagai nukleofil yang
akan menyerang atom karbon pada cincin piranosa. Atom karbon yang diserang adalah pada
posisi satu. Hal ini dikarenakan atom karbon posisi satu merupakan atom yang berinteraksi
langsung dengan atom oksigen. Adanya atom oksigen merupakan atom yang elektronegatif.
Akibat dari atom oksigen, atom karbon pada posisi satu menjadi bermuatan parsial positif yang
disukai oleh nukliofil. Serangan dari nukliofil mengaktifkan atom oksigen pada ikatan
glukosida yang akan menyerang atom hidrogen pada asam glutamat. Asam glutamat
merupakan gugus asam amino yang bertindak sebagai donor proton. Proton yang didonorkan
akan diterima oleh atom oksigen sehingga atom oksigen bersama gugus samping R dapat lepas
menjadi senyawa R-OH. Dimana OR merupakan senyawa dari substrat yang akan stabil
dengan adanya proton yang disumbangkan oleh asam glutamat.

Mekanisme selanjutnya adalah adanya air dalam tahapan reaksi. Disini air bertindak
sebagai nukliofil sekaligus sebagai asam. Air yang bertindak sebagai nukliofil akan menyerang
atom karbon pada nomor 1, sehingga ikatan dengan enzim akan terputus. Elektron yang berada
pada atom karbon didonorkan kepada atom oksigen. Hal ini terjadi karena keelektronegatifan
dari atom karbon yang kuat sehingg ikatan putus dan glutamat akan kembali lagi ke dalam
bentuknya yang bertindak sebagai nukliofil. Atom oksigen pada glutamat akan menyerang
proton pada molekul air yang berlangsung secara bersamaan dengan proses penyerangan air ke
atom karbon. Akibat dari serangan ini akan mengembalikan kondisi dari glutamat ke dalam
bentuk asam glutamat.

5. Kinetika Enzim β-galaktosidase

Penentuan nilai KM dan Vmaks berguna untuk menganalisis afinitas enzim dengan
substrat spesifiknya, menentukan kecepatan reaksi enzim pada suatu tertentu. Michaelis-
Menten mendefinisikan suatu tetapan yang dinyatakan sebagai tetapan Michaelis-Menten
(KM) adalah konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan
maksimumnya. Kecepatan maksimum (Vmaks) adalah kecepatan yang berangsur-angsur
dicapai pada konsentrasi substrat tinggi. Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan
aljabar bagi bentuk hiperbolik kurva tersebut dengan parameter pentingnya adalah konsentrasi
substrat ([S]), kecepatan awal (V0), Vmaks, dan KM. Persamaan ini menjadi dasar bagi semua
penelitian kinetika enzim karena memungkinkan perhitungan kuantitatif sifat-sifat enzim dan
analisis penghambatan enzim (Lehninger,2004).

Elis-Menten menunjukkan hubungan antara konsentrasi oNPGal dengan kecepatan β-

galaktosidase hasil purifikasi. Nilai Km dan Vmaks ditentukan dari kurva Line-Weaveburk.
Persamaan Line-Weaveburk diperoleh y=1.200x+0,305 dengan nilai regresi sebesar 0.963.
berdasarkan persamaan tersebut diketahui Km sebesar 3.934 mM dengan Vmaks sebesar 3.278
mol/menit.

6. Bioinformatika Enzim β-galaktosidase

β-galaktosidase merupakan tetramer empat rantai polipeptida yang identik, masing-
masing 1023. Struktur kristal awalnya ditentukan dalam bentuk kristal monoklinik dengan
empat tetramers asimetris Selanjutnya struktur itu disempurnakan untuk resolusi 1,7 di kristal
ortorombik dengan tetramer tunggal di unit asimetris Bentuk terakhir ini secara teknis lebih
unggul dan telah digunakan untuk studi struktural dan fungsional berikutnya.

Dalam setiap monomer, 1023 asam amino membentuk lima domains. Domain ketiga
(tengah) (residu 334-627) adalah isomerase disebut triosa fosfat (TIM) atau barel α8β8 dengan
sisi aktif membentuk sebuah lubang yang dalam di ujung C-terminal. Sebagaimana dicatat di
bawah ini, elemen-elemen penting dari sisi aktif juga disumbangkan oleh asam amino dari
tempat lain dalam rantai polipeptida yang sama serta dari rantai lain dalam tetramer tersebut.

Enzim merupakan protein yang tersusun oleh asam amino. Teknologi informatika
dmanfaatkan sebagai modeling untuk mengurutkan asam amino yang menyusun protein.
Urutan asam amino ini disebut dengan sequencing.

DAFTAR PUSTAKA

Baehaki Ace, Maggy T. Suhartono, Nurheni Sri Palupi, dan Tati Nurhayati. 2008. Purifikasi
dan Karakterisasi Protease dari Bakteri Patogen Pseudomonas aeruginosa. Jurnal.
Teknol Dan Industri Pangan 19(1):80-87.
Bintang, Maria. 2010. Biokimia: Teknik penelitian. Jakarta: EGC.
Hames B.D. dan Hoper N.M. 2000. Biochemistry: The instant notes. 2nd Ed. Hongkong:
SpringerVerlag.
Hartono, Lusiana Krisnawati. 2013. Purifikasi Parsial Dan Karakterisasi Β Galaktosidase
Dari Isolat Bakteri Asam Laktat (Bal) Strain B13.[serial
online]. http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/64688 .[diakses tanggal 5 Juni
2015].
Natarajan Jayashree et al. 2012. Isolation and Characterization of β-Galactosidase Producing
Bacillus sp. from Diary Effluent. World Appl. Sci. J. 17(11):1466-1474.
Nelson, David L dan Cox Michael M. 2008. Lehninger: Principles of Biochemistry. New
York: W.H Freeman and Company.
Richardson T dan DB Hyslop. 1985. Enzim dalam O.R. New York: Bekker Inc.