ANALISIS AKTIVITAS CMCASE

Oleh :
Kelompok 1
Nur Afni Helia Dewi (191810401002)
Viruria Stya Ciputri (191810401005)
Nadia Eka Ningtyas (191810401009)
Moh. anas afandi yusuf (191810401023)
Rifkah Ajeng Anjani (191810401024)
Nawang Wulan (191810401028)
Wasiatur Roziqoh (191810401041)
Siti Khasanah (191810401042)
Bayu Arifin (191810401062)

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2020
I. PENDAHULUAN
Selulosa merupakan senyawa organik yang terdapat pada
dinding sel bersama lignin yang berperan dalam memperkuat struktur
tumbuhan. CMCase (endoselulase, endoglukanase atau endo-1,4 β-
D-glukanase), Avicelase (sellobiohidrolase, eksoselulase atau ekso-
1,4-β-D-glukanase), dan aktivitas selulase yang lain yaitu sellobiase
(β-glukosidase) bersinergi dalam proses degradasi selulosa secara
alami. Eksoglukanase bekerja terhadap ujung pereduksi dan
nonpereduksi rantai polisakarida selulosa atau memutus ikatan (β-
1,4) glikosidik pada ujung-ujung selulosa yang berbentuk kristalin dan
menghasilkan selobiosa sebagai produk utama dan rantai selulosa
yang lebih pendek. Endoglukanase akan memutus secara acak
bagian dalam selulosa yang berbentuk amorf sehingga
menghasilkan oligosakarida yang bervariasi panjangnya dan
menghasilkan ujung rantai baru (Rahmadani dan Susanti, 2013).
Endo-1,4-β-D-glucanase (endoselulase, carboxymethylcellulase atau
CMCase), yang mengurai polimer selulosa secara random pada ikatan
internal ɑ-1,4-glikosida untuk menghasilkan oligodekstrin dengan
panjang rantai yang bervariasi. Aktivitas selulase yang lain yaitu
sellobiase (β-glukosidase) bersinergi dalam proses degradasi
selulosa secara alami. Enzim β-glukosidase akan menghidrolisis
selobiosa menjadi monomermonomer glukosa (Ikram et al, 2005).
Selulase merupakan salah satu enzim komersial yang
memiliki nilai jual sangat tinggi. Enzim selulase secara luas
digunakan dalam berbagai industri yaitu produksi makanan, tekstil,
loundry, pembuatan roti dan bir serta industri kertas. Beberapa
jenis karbohidrat telah digunakan sebagai induser. Selulosa adalah
induser alamiah yang banyak digunakan. Karbohidrat lain yaitu
karboksimetilselulosa (CMC), sophomers, lactose dan avicel juga
telah digunakan sebagai induser. Konsentrasi selulosa juga
memengaruhi pertumbuhan mikroba selulolitik dan produksi
selulasenya (Rahmadani dan Susanti, 2013).
Beberapa genus fungi yang dimanfaatkan untuk menghasilkan
enzim selulase antara lain Trichoderma, Aspergillus, Mucor, dan
Penicilium (Kusnadi et al, 2007). Menurut Zahroh (2011) menyatakan
bahwa isolat memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim selulase
karena mampu hidup pada bahan yang mengandung lignoselulosa
 (terdiri dari selulosa, hemiselulosa, dan lignin). Kemampuan isolat
kapang untuk menghasilkan enzim selulase dapat dibuktikan dengan
menumbuhkan kapang pada media selektif yakni CMC (Carboxymethil
cellulose). Kemampuan isolat kapang dalam mendegradasi CMC
dapat ditandai dengan adanya daerah bening (halo) disekitar koloni
ketika diwarnai dengan Congo red. Kemampuan untuk menghasilkan
enzim selulase dapat diketahui dari besarnya indeks hidrolisis. Nilai
indeks hidrolisis dari masing-masing isolat kapang selulolitik yang telah
diteliti Zahroh (2011) adalah B1 0,29; B2 0,26; B3 0,12; B4 0,11. Dua
isolat kapang telah diketahui genusnya, yaitu isolat B1 Aspergillus dan
B2 Mucor. Aspergillus sp. Memiliki indeks hidrolisis terbesar yaitu 0,29.
Kapang memainkan peranan penting dalam mendaur ulang
mineral dan karbon. Kapang diperkirakan mendaur ulang jutaan ton
sampah organik di lingkungan alamiah pada setiap tahun. Kapang
dapat mensintesis protein dengan mengambil sumber karbon dari
karbohidrat (misalnya glukosa, fruktosa, dan sukrosa) sumber nitrogen
dari organik maupun anorganik dan mineral dari substratnya. Kapang
juga dikenal sebagai penghasil enzim dalam proses biodegradasi
substrat organik (Fardiaz, 1992).

II. METODE
2.1 Alat
 Mikro pipet 1000 μl da 5000 μl
 Spectrophotometer
 Waterbath
 Tabung reaksi
 Erlenmeyer
 Sentrifuge
 Mikroskop
 Cawan petri

2.2 Bahan
 Carboxymethylcellulose (CMS)
 Reagen DNS
 Laruta Glukosa
 Crude enzim dari Aspergillus sp.
 Buffer citrate phosphate pH 6.0
 Akuades steril
 Media jagung dan kedelai
 1% NaCl
 Toluene
 Kloramfenikol 50 ppm
 Medium agar dan medium PDA miring

2.3 Skema Kerja

a. Produksi CMCase
Persiapan Inoculum
Biakan Aspergillus sp. yang berumur ± 1 minggu (sudah berspora)

dilarutkan ke dalam akuades steril sebanyak 5 ml

diinokulasikan dalam media jagungdan dan kedelai

diinkubasi selama 3 hari

diambil dan disimpan supernatant di mikrotube untuk analisis

kualitatis (celluase dan amilase)

Uji Kuantitatif

Sisa Kultur

ditambah dengan 1% NaCl 15 ml dan 1 tetes (50 μl) toluene

digojog selama 2 hari, setelah itu disentrifugasi selama 10 menit pada

kecepatan 5000 rpm
b. Ekstraksi CMCase Ekstraseluler dari Kapang
Isolasi kapang selulolitik dari limbah pengolahan sagu yang telah
disimpan selama ± 2 tahun
selama ± 2 tahun
pengolahan sagu yang telah disimpan
medium agar
dilakukan dengan teknik direct plating,
selama pada
± 2 tahun yang
mengandung dan kloramfenikol 50 ppm di dalam
1% CMC
cawan petri

diinkubasi pada suhu 28C selama 4-6 hari

diamati koloni kapang yang menunjukkan perbedaan morfologi

makroskopis (warna, bentuk, dan persebaran koloni)

diisolasi ke medium PDA miring

diinkubasi pada suhu 28C selama 4-5 hari

dibuat preparat dari isolat kapang yang diperoleh dan diamati di

bawah mikroskop

dilakukan pengamatan mikroskopis pada kultur berumur 4-5 hari

pada , dan diinkubasi pada suhu ruang
medium PDA miring

diamati hasil mikroskopis yang menunjukkan karakteristik Aspergillus sp.

dilakukan pengujian aktivitas selulolitik untuk mengetahui apakah isolat

mampu menghasilkan enzim selulase

c. Pembuatan Kurva Standar Glukosa

Larutan glukosa 1000 μg/ml
 dibuat larutan standar glukosa dengan seri pengenceran menggunakan
buffer pH yang sesuai, sehingga didapatkan konsentrasi
glukosa sebesar 50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml,
250 μg/ml, 300 μg/ml, dan 350 μg/ml ke dalam setiap tabung reaksi

ditambahkan DNS sebanyak 3 ml, kemudian dipanaskan dalam air

mendidih selama 15 menit

Kontrol berupa 1 ml CMC dalam buffer dan penambahan enzim

dilakukan setelah ditambah reagen DNS , sedangkan blanko berupa
1 ml akuades dan 1 ml buffer

diukur absorbasinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

540 nm

dibuat kurva standar hubungan antara Optical Density (OD) dan kadar
glukosa μg

d. Uji Aktivitas CMCase

1 ml enzim

dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 ml larutan CMC 1%

dalam buffer

diinkubasi pada suhu 50C selama 30 menit

 ditambahkan DNS sebanyak 3 ml, kemudian dipanaskan dalam air
mendidih selama 15 menit pada waterbath

Kontrol berupa 1 ml CMC dalam buffer dan penambahan enzim

dilakukan setelah ditambah reagen DNS , sedangkan blanko berupa
1 ml akuades dan 1 ml buffer

diukur absorbasinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

540 nm

dibuat kurva standar hubungan antara Optical Density (OD) dan kadar
glukosa μg

satu unit aktivitas CMCase merupakan banyaknya enzim yang dapat

memproduksi 1 μmol glukosa dalam 1 menit

III. HASIL
3.1 Hasil
Table hasil

Konsentrasi Ulangan Nilai Ansorbansi

glukosa (μg/μL) pada OD540
0 0 0 0
50 0.135 0.127 0.143
100 0.250 0.265 0.247
150 0.386 0.376 0.368
200 0.456 0.467 0.439
250 0.613 0.632 0.611
300 0.786 0.766 0.801
350 0.917 0.922 0.935
Kurva standar

Hasil perhitungan
Sampel A 0.0026 X = 0.7183
Y = 0.0026 X - 0.0103 X= 0.7183/0.0026
0.764= 0.0026 X - X= 276,269
0.0103
0.0026 X= 0.764
+0.0103 Sampel C

0.0026 X = 0.7743 Y = 0.0026 X - 0.0103

X= 0.7743/0.0026 0.695= 0.0026 X -

0.0103
X= 297,808
0.0026 X= 0.695
Sampel B +0.0103
Y = 0.0026 X - 0.0103 0.0026 X = 0.7053
0.708= 0.0026 X - X= 0.7053/0.0026
0.0103
X= 271,269
0.0026 X= 0.708
+0.0103
 3.2 pembahasan
Uji aktivitas enzim dilakukan dengan metode CMCase menggunakan
reagen DNS (asam 3,5-dinitrosalisilat) untuk mengamati jumlah glukosa yang
terbentuk. Karena enzim selulase ini berfungsi untuk menghidrolisis substrat
selulosa menjadi monomer gula pereduksinya berupa glukosa. Jumlah glukosa
yang terbentuk akan dikonversi ke dalam bentuk IU (International Unit). Satu
unit (IU) artinya sejumlah enzim selulase yang dapat membebaskan 1 μmol
gula pereduksi dalam kondisi percobaan per satuan waktu Pengujian aktivitas
enzim selulase ini menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan panjang
gelombang 540nm (Wahyuningtyas et al., 2013).

CMCase digunakan sebagai subtrat dari enzim selulase. Satu unit

aktivitas enzim selulase di definisikan kemampuan enzim selulase yang dapat
menghasilkan 1 mg/mL glukosa pada kondisi optimum. Jumlah gula
pereduksi (glukosa). Metode dinitrosalicylic (DNS) atau Somogy-Nelson .
Metode DNS dengan menggunakan pereaksi DNS untuk mengukur gula
reduksi yang diproduksi oleh mikroba memiliki tingkat ketelitian yang tinggi
sehingga dapat diaplikasikan pada gula dengan kadar yang sangat kecil.
Metode DNS dipilih pada penelitian ini karena merupakan metode yang
praktis dan mudah dilakukan untuk pengukuran sampel. Sedangkan metode
Somogy-Nelson memiliki kekurangan pada perlakuan analisis yang lama dan
lebih rumit serta tingkat bahaya racunnya lebih tinggi bila dibandingkan
dengan metode DNS (Irawati, 2016).

IV. KESIMPULAN

Praktikum analisis CMCase kali ini dilakykakn uji aktivitas enzim

dilakukan dengan metode CMCase menggunakan reagen DNS (asam
3,5-dinitrosalisilat) untuk mengamati jumlah glukosa yang terbentuk.
CMCase digunakan sebagai subtrat dari enzim selulase. Metode DNS
dengan menggunakan pereaksi DNS untuk mengukur gula reduksi
yang diproduksi oleh mikroba memiliki tingkat ketelitian yang tinggi
sehingga dapat diaplikasikan pada gula dengan kadar yang sangat
kecil. Metode Somogy-Nelson memiliki kekurangan pada perlakuan
analisis yang lama dan lebih rumit serta tingkat bahaya racunnya lebih
tinggi bila dibandingkan dengan metode DNS
 DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, S. 1992. Biotransfomation Inorganik Reaction. Jakarta: PT. Gramedia

Pratama Utama.
Ikram, M.M.J., Tehmina S.K., dan Zafar S. 2005. Cotton Saccharifying Activity Of
Cellulases Produced by Co-clture of Aspergillus niger and Trichoderma
viride. J. Agric & Biol. Sci. Vol. 1(3): 241-245.
Irawati, Rosyida. Karakterisasi pH, Suhu dan Konsentrasi Substrat Pada Enzim
Selulase Kasar Yang Diproduksi Oleh Bacillus Circulans. Skripsi.
Malang: Fakultas Sains Dan Teknologi UIN Maulana Malik Ibrahim,
2016.
Kusnadi., Saefudin, dan Astri E. 2007. Keanekaragaman Jamur Selulolitik dan
Amilolitik Pengurai Sampah Organik dari Berbagai Substrat. Bandung:
Universitas Pendidikan Indonesia.
Rahmadani, Amrullah Hamdan., dan Susanti, Evi. 2013. Kajian Potensi Limbah
Pertanian Sebagai Sumber Karbon Pada Produksi Avicelase dan CMCase
dari Bacillus circulans. Valensi. Vol. 3(2): 82-87.
Wahyuningtyas, P., Argo, B.D., dan Nugroho, W.A..2013. Studi Pembuatan
Enzim Selulase dari Mikrofungi Trichoderma reesei dengan
Substrat Jerami Padi sebagai Katalis Hidrolisis Enzimatik pada
Produksi Bioetanol. Jurnal Bioproses Komoditas Tropis. 1(1): 21-
25
Zahroh, Aminah. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Kapang
Tandan Kosong Kelapa Sawit. Surabaya: Universitas Airlangga.