prosiding seminar nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan dan perikanan 2010

KARAKTERISASI ENZIM KOLAGENASE ORGAN DALAM IKAN PATIN

(Pangasius pangasius)
Roni Nugraha*), Lily Viruly*), Nurlaila Ervina Herliany*), Suwarjoyowirayatno*), Mutia Hikmawati*),
Untung Trimo. L*), dan Deni Syaputra*)
ABSTRAK
Kolagenase merupakan salah satu enzim proteolitik penyebab proses kemunduran mutu
ikan. Kolagenase memutus ikatan peptida jaringan ikat daging dan mengakibatkan tekstur ikan
menjadi lembek. Penelitian ini bertujuan mengekstrak enzim kolagenase dari organ dalam ikan
patin. Aktivitas tertinggi enzim kolagenase ditemukan pada pankreas. Kolagenase dimurnikan
dengan amonium sulfat dan dialisis kemudian diukur berat molekulnya dengan metode SDSPAGE. Kolagenase hasil pemurnian amonium sulfat memiliki aktivitas sebesar 1,6 U/mL,
meningkat 15 kali dibandingkan ekstrak kasar kolagenase. Hasil elektroforesis menunjukkan
kolagenase dengan aktivitas tertinggi memiliki berat molekul 89,93 kDa. Kolagenase memiliki
aktivitas optimal pada pH 7 dan suhu 50C.
Kata kunci: Pangasius pangasius, kolagenase, pankreas, enzim proteolitik

PENDAHULUAN
Indonesia memiliki potensi perikanan yang sangat besar, baik perikanan laut maupun perikanan darat.
Salah satu komoditas perikanan darat yang diminati adalah ikan patin. Ikan patin memiliki kandungan protein
tinggi yaitu lebih dari 65% (Setijaningsih et al., 2006). Kandungan gizi ikan patin akan menjadi tidak bernilai
apabila tidak ditangani dengan baik setelah penangkapan ataupun pemanenan. Hal ini disebabkan ikan
merupakan bahan pangan yang sangat rentan terhadap kerusakan (highly perishable food).
Proses kerusakan atau kemunduran mutu ikan disebabkan oleh aktivitas enzim dan mikroorganisme.
Kemunduran mutu ikan diawali adanya proses autolisis oleh enzim dan tidak berhubungan dengan aktivitas
mikroorganisme (Gram & Huss, 1996). Selama proses kemunduran mutu, asam amino meningkat sebagai
akibat kerja enzim proteolisis. Pemecahan ini menyebabkan kerusakan jaringan daging ikan dan ditandai
dengan melemasnya daging ikan (Shigemura et al., 2003). Selain itu, proteolisis juga menghasilkan molekulmolekul yang menjadi sumber makanan bagi mikroorganisme untuk tumbuh.
Enzim-enzim pencernaan seperti katepsin, kimotripsin, tripsin, karboksipeptidase, kolagenase, dan kalpain
merupakan enzim-enzim proteolitik yang berperan dalam proses kemunduran mutu ikan (Huss, 1995). Hasil
penelitian Hernandez-Herrero et al. (2003) menunjukkan bahwa selama proses dekomposisi protein ikan,
aktivitas kolagenase meningkat secara cepat dan bersama protease lainnya bertanggung jawab dalam proses
pemecahan jaringan kolagen ikan cod. Kolagenase merupakan enzim yang berperan dalam proses hidrolisis
kolagen, protein yang berperan dalam menyatukan myocommata. Pemutusan kolagen menyebabkan fenomena
gaping, yaitu pemutusan jaringan ikat otot dengan myocommata (Fletcher et al., 1997).
Aktivitas kolagenase ditemukan di berbagai organ pencernaan antara lain pankreas, pilorik kaeka, usus,
dan mesenterium (Yoshinaka et al., 1978a). Aktivitas optimum kolagenase berada pada kisaran pH 7-9. Kim
et al. (2002) membagi kolagenase menjadi dua jenis, yaitu metallokolagenase dan serin kolagenase.
Metallokolagenase merupakan protease ekstraseluler yang terlibat dalam proses katabolisme jaringan ikat
(Delbarre-Ladrat et al., 2006) dan memiliki berat molekul antara 30-150 kDa (Park et al., 2002) sedangkan
serin kolagenase terlibat dalam produksi hormon dan farmakologi peptida aktif.
Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi kolagenase yang diekstrak dari organ dalam pencernaan ikan
patin. Pemanfaatan organ-organ tubuh ikan yang berpotensi sebagai limbah industri filet seperti jeroan termasuk
pankreas, menjadi hal yang penting untuk direncanakan dalam rangka mewujudkan konsep zero waste dan
added value.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain organ dalam ikan patin (usus dan pankreas) yang
dibersihkan dengan akuades dan disimpan dalam freezer, kolagen yang diambil dari kulit ikan patin, kantung
*)

Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB; E-mail: roni_nugrahai@yahoo.com

19

prosiding seminar nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan dan perikanan 2010

dialisis dengan MWCO 12 kDa, amonium sulfat, L-leusin sebagai standar uji aktivitas kolagenase, bovine
serum albumin sebagai standar dalam penentuan kadar protein, reagen untuk elektroforesis dan marker berat
molekul.
Metode
Penelitian diawali dengan preparasi organ dalam ikan patin, kemudian dilanjutkan dengan pemurnian
kolagenase. Isolasi enzim terdiri dari tiga tahap, yaitu ekstraksi, pengendapan, dan dialisis. Karakterisasi
kolagenase dilakukan terhadap ekstrak kasar dan hasil pengendapan terbaik, meliputi penentuan pH optimum,
dengan pH yang diujikan yaitu pH 6-8, suhu optimum, dengan suhu yang diujikan 40-60oC. Substrat untuk uji
aktivitas kolagenase adalah kolagen yang dibuat dari kulit ikan patin.
Ekstraksi kolagenase organ dalam ikan patin
Ekstraksi kolagenase mengacu pada Kim et al. (2002). Secara ringkas, ekstraksi kolagenase dilakukan
dengan menghancurkan usus dan pankreas sampai homogen dalam larutan 100 mM buffer Tris HCl (pH 8.0)
yang mengandung 0,25% Triton dan 10 mM CaCl2. Homogenat disentrifugasi pada 7000xg selama 20 menit
pada suhu dingin (4oC). Endapan diekstraksi kembali dengan penambahan buffer yang sama sebanyak 3x
volume endapan. Supernatan dari sentrifugasi pertama dan kedua dikumpulkan dan dicampur dengan 20 mM
buffer Tris HCl (pH 8,0) yang mengandung 0,36 mM CaCl2 kemudian didiamkan selama 48 jam dan menjadi
ekstrak kasar kolagenase.
Ekstrak kolagenase kasar selanjutnya dimurnikan dengan penambahan amonium sulfat dengan tingkat
kejenuhan 70%. Endapan dikumpulkan dan dilarutkan dengan sedikit larutan 20 mM buffer Tris HCl (pH 8)
yang mengandung 0,36 mM CaCl2 kemudian didialisis. Dialisis menggunakan kantung berukuran 8.000 MWCO
dengan waktu dialisis selama 6 jam. Buffer yang digunakan adalah buffer Tris HCl 2 mM mengandung CaCl2
0,036 mM dengan volume 100 kali volume sampel (Scopes, 1982).
Uji aktivitas kolagenase
Aktivitas kolagenase dianalisis menggunakan metode spektrofotometri mengikuti prosedur Kim et al.
(2002) dengan sedikit perubahan. Sebanyak 0,1 mL larutan kolagenase ditambah dengan 5 mL larutan kolagen
dan 1 mL 0,05 mM Tris-HCl pada pH 8,0 yang mengandung 5 mM CaCl2. Reaksi ini dilakukan pada suhu 37oC
selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan penambahan 0,2 mL 0,5% TCA dan diinkubasi selama 10 menit
pada suhu ruang. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada 1.800 rpm selama 20 menit. Supernatan, sebanyak
1 mL dicampur dengan 1,0 mL larutan ninhidrin, diinkubasi pada suhu 100oC selama 20 menit, kemudian
didinginkan pada suhu ruang. Campuran kemudian ditambah dengan 5 mL 50% 1-propanol dan diukur
serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer Tris-HCl
digunakan sebagai blanko dan L-leusin digunakan sebagai standar.
Karakterisasi kolagenase organ dalam ikan patin
Karakterisasi bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas kolagenase sehingga penggunaannya
dapat disesuaikan dengan karakter tersebut. Selain itu juga untuk mengetahui dan mengontrol kemurnian
pada setiap tahap dalam proses pemurnian. Karakterisasi kolagenase meliputi penentuan suhu optimum,
dan pH optimum. Kisaran pH yang akan diujikan, yaitu 6,0-8,0 dan suhu 40-60 oC.
Analisis kadar protein
Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford (1976). Bovine serum albumin digunakan
sebagai standar. Absorban diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nM.
Penentuan berat molekul
Berat molekul ditentukan menggunakan gel elektroforesis SDS-PAGE dengan standar protein BM rendah.
Pita protein diwarnai dengan Commassie Briliant Blue R-250. Standar protein yang digunakan antara lain
fosforilase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), karbonik anhidrase (30 kDa), dan inhibitor
tripsin (20,1 kDa) .

20

prosiding seminar nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan dan perikanan 2010

Zimogram kolagenase
Zimogram kolagenase menggunakan metode modifikasi Cottrell et al. (1999) dengan substrat 0,01%
kolagen. Pita protein diwarnai dengan Commassie Briliant Blue R-250. Standar protein yang digunakan antara
lain fosforilase b (97 kDa), albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), karbonik anhidrase (30 kDa), inhibitor tripsin
(20,1 kDa) dan lactalbumin (14,4 kDa). Panjang migrasi dari tiap pita yang dihasilkan diukur kemudian
dibandingkan dengan marker dan ditentukan berat molekulnya.
HASIL DAN BAHASAN
Ekstraksi Kolagenase
Ekstraksi merupakan tahap awal isolasi kolagenase. Pada penelitian ini, ekstraksi dilakukan secara
terpisah terhadap dua organ dalam yaitu usus dan pankreas pada fase post rigor. Hasil uji aktivitas ekstrak
kasar kolagenase pada kedua organ menunjukkan bahwa aktivitas kolagenase pada pankreas 15 kali lebih
tinggi dibandingkan pada usus (Gambar 1). Hasil ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Yoshinaka
et al. (1978a) pada ikan Parasilurus asotus.

Aktivitas Enzim (U/mL)

Kolagenase merupakan salah satu protease yang ditemukan dalam organ dalam ikan. Enzim ini berperan
dalam proses pencernaan kolagen yang berhubungan dengan makanan alamiahnya (Yoshinaka et al. 1978b).
Hasil penelitian Yoshinaka et al. (1978a) pada 19 jenis ikan menunjukkan bahwa kolagenase terdistribusi
pada organ-organ dalam ikan seperti usus, pilorik kaeka, pankreas, dan mesenterium. Peneliti yang sama
juga mendapati bahwa aktivitas kolagenase tertinggi pada organ dalam rainbow trout ditemukan pada jaringan
berlemak diantara pilorik kaeka. Oleh karena itu, diduga pankreas, merupakan sumber utama dari enzim
kolagenase karena organ pankreas pada rainbow trout tergabung dalam jaringan berlemak diantara kaeka.
0,016
0,014
0,012
0,01
0,008
0,006
0,004
0,002
Usus

Pankreas

Gambar 1. Aktivitas kolagenase pada dua organ dalam ikan patin fase post rigor.
Pemurnian Kolagenase
Enzim kolagenase dimurnikan dengan amonium sulfat dan dilanjutkan dengan dialisis. Hasil pemurnian
enzim kolagenase disajikan pada Tabel 1. Kemurnian enzim meningkat hampir 16 kali setelah dimurnikan
dengan ammonium sulfat. Penambahan amonium sulfat dilakukan karena sifatnya mudah larut, murah, dan
umumnya tidak mempengaruhi struktur protein pada konsentrasi tertentu (Beynon & Bond, 2001). Meningkatnya
aktivitas enzim pada endapan hingga penambahan amonium sulfat 70% disebabkan berkurangnya pengotor
seperti non protein (karbohidrat), protein non enzim dan lain-lain (Suhartono, 1989).
Tabel 1. Perbandingan aktivitas untuk setiap tahap pemurnian
Tahap Pemurnian
Ekstrak kasar
Amonium sulfat

Total Protein

Aktivitas Enzim

Total Aktivitas

AktivitasSpesifik

(mg)
15,25

(U/mL)
0,0152

(U)
0,760

(U/mg)
0,05

2,04

1,6

1,600

0,78

Kelipatan
Pemurnian
1
15,7

21

prosiding seminar nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan dan perikanan 2010

Setelah proses presipitasi dengan amonium sulfat, dilakukan dialisis untuk mengurangi kadar garam
(desalting) yang tersisa. Perbedaan tekanan osmosis dari larutan buffer yang mengandung konsentrasi
garam rendah (hipotonik) dengan larutan enzim dalam kantong dialisis yang mengandung garam tinggi
(hipertonik) menyebabkan garam terdifusi keluar membran kantung dialisis, biasanya bersifat semipermeabel.
Dialisis mengeluarkan protein dengan ukuran yang lebih kecil dari ukuran pori-pori kantung dialisis. Dialisis
yang dilakukan dengan mengganti buffer beberapa kali akan meningkatkan kemurnian enzim. Lama waktu
difusi dan ukuran kantong dialisis serta konsentrasi buffer menentukan hasil dialisis. Dialisis selama 6 jam
menggunakan kantong dialisis dengan 12 kDa MWCO.
Penentuan Berat Molekul
Berat molekul kolagenase dari pankreas ikan patin ditentukan dengan SDS-PAGE dari protein hasil
pemurnian dengan dialisis. Hasil elektroforesis menunjukkan sampel dialisis masih mengandung beberapa
jenis protein (Gambar 2A) dengan didominasi oleh protein berukuran 18,87 kDa. Zimografi terhadap kolagen
dilakukan untuk menentukan aktivitas kolagenase dari tiap-tiap pita protein. Zimogram menunjukkan aktivitas
kolagenase paling tinggi terlihat pada pita dengan berat molekul 89,93 kD (Gambar 2B).
Kolagenase pankreas ikan patin memiliki berat molekul 89,93 kDa. Kolagenase pankreas ikan patin
memiliki berat molekul yang lebih tinggi dibandingkan kolagenase dari organ dalam ikan filefish (Novoden
modestru, 27 kDa) (Kim et al., 2002), organ dalam ikan makarel (Scomber japonicus; 14,8 kDa) (Park et al.
2002), daging filefish (Novoden modestrus; 42,0 kDa) (Kim & Kim, 1991), dan hepatopankreas udang (Pandalus
eous, 22-23 kDa) (Aoki et al., 2003). Berdasarkan berat molekul, diduga kolagenase pankreas ikan patin
termasuk dalam golongan metallokolagenase. Berat molekul metallokolagenase bervariasi dari 30 hingga
150 kDa. Kolagenase dari daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp.) mempunyai berat molekul 47 dan 95
kDa (Brocho & Haard 1995).

Gambar 2. (A) Elektrogram hasil pemurnian dialisis, (B) Zimogram kolagenase pankreas ikan patin
Efek pH dan Temperatur
Kolagenase dari pankreas ikan patin berkerja secara efektif pada pH 7 (Gambar 3). Pada spesies yang
lain, seperti ikan makarel (Scomber japanicus) (Park et al., 2002) dan ikan tuna (Thunnus thynnus) ( (Byun et
al., 2002), kolagenase mempunyai pH optimum 7,5; kolagenase udang (Aoki et al. 2003) dan daging ikan
Pasific rockfish (Sebastes sp.) (Brocho & Haard, 1995), mempunyai pH optimum 7,5-8,5; sedangkan kolagenase
dari usus ikan bandeng memiliki pH 7,0-8,0 (Yuniarti et al., 2009).
Temperatur optimum untuk kolagenase pankreas ikan patin berada pada suhu 50C (Gambar 4). Enzim
bekerja secara maksimum pada suhu tertentu. Aktivitasnya akan terus meningkat seiring dengan meningkatnya
suhu sehingga dicapai suhu yang optimum, setelah melewati suhu optimum, aktivitasnya akan kembali menurun
(Pelezar & Chan, 1988). Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa suhu optimum kolagenase berkisar
antara 40-60C ( Kim & Kim, 1991, Byun et al., 2002, Kim et al., 2002; Park et al., 2002).

22

prosiding seminar nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan dan perikanan 2010

Gambar 3. Aktivitas kolagenase pada berbagai pH

Gambar 4. Aktivitas kolagenase pada berbagai suhu

KESIMPULAN
Aktivitas kolagenase tertinggi ditemukan pada pankreas ikan patin dengan aktivitas sebesar 0,015 U/mL.
Hasil pemurnian dengan amonium sulfat mampu meningkatkan aktivitas enzim sebesar 15 kali lebih tinggi
dibandingkan ekstrak kasarnya. Kolagenase pankreas ikan patin memiliki berat molekul 89,93 kDa dan
bekerja secara optimal pada pH 7 dan suhu 50C. Penelitian lebih lanjut perlu dilaksanakan untuk mengetahui
efek ion logam dan inhibitor terhadap aktivitas enzim. Selain itu diperlukan pemurnian lebih lanjut untuk
meningkatkan aktivitas enzim kolagenase.
DAFTAR PUSTAKA
Aoki, H., Ahsan, M.N., Matsuo, K., Hagiwara, T., and W atanabe, S. 2003. Purification and characterization of
collagenolytic protease from the hepatopancreas of northern shrimp (Pandalus eous). J. Agric Food Chem.
51(3): 777-783.
Beynon, R.J. and Bond, J.S. 2001. Proteolytic Enzymes: a Practical Approach. Oxford University Press, New York.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248-254.
Brocho, G.E. and Haard, N.F. 1995. Identification of two matrix metalloproteinase in the skeletal muscle of pacific
rockfish (Sebastes sp.). J. Food Biochem. 19: 299-319.
Byun, H.G., Park, J.P., Sung, N.I., and Kim, S.K. 2002. Purification and characterization of a serine proteinase from
the tuna pyloric caeca. J. Food Biochem. 26(6): 479-494.

23

prosiding seminar nasional pengolahan produk dan bioteknologi kelautan dan perikanan 2010
Cottrell, M.T., Moore, J.A., and Kirchman D.L. 1999. Chitinases from uncultured marine microorganisms. Applied
and Environmental Microbiology. 65(6): 2553-2557.
Delbarre-Ladrat, C., Chret, R., Taylor, R., and Verrez-Bagnis., V. 2006. Trends in postmortem aging in fish:
understanding of proteolysis and disorganization of the myofibrillar structure. Critical Reviews In Food Science
and Nutrition. 46(5): 409-421.
Fletcher, G.C., Hallett, I.C., Jerrett, A.R., and Holland, A.J. 1997. Changes in the fine structure of the myocommata
muscle fibre junction related to gaping in rested and exercised muscle from king salmon (Oncorhynchus
tshawytscha). Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 30: 246252.
Gram, L., and Huss, H.H. 1996. Microbiological spoilage of fish and fish products. International Journal of Food
Microbiology . 33: 121-137.
Hernandez-Herrero, M.M., Duos, G., Malle, P., and Bouquelet, S. 2003. Collagenase activity and protein hydrolysis
as related to spoilage of iced cod (Gadus morhua). Food Research International. 36: 141147.
Huss, H.H. 1995. Quality and quality changes in fresh fish. FAO Fisheries Technical Paper . FAO. 348:195.
Kim, S.K., Park, P.J., Kim, J.B., and Shahidi, F. 2002. Purification and characterization of a collagenolytic protease
from the filefish, Novoden modestrus. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35(2): 165-171.
Kim, Y.T., and Kim, S.K. 1991. Purification and characteristization of a collagenase from tissue of filefish (Novodon
modestrus). Korean Biochem J. 24: 401-409.
Park, P.J., Lee, S.H., Byun, H.G., Kim, SH., Kim S.K. 2002. Purification and characterization of a collagenase from the
mackerel, Scomber japonicus. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 35(6): 576-582.
Pelezar, M.J.Jr. and Chan, E.C.S. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Volume 1. Hadioetomo, R.S., Imas, T., Tjitrosomo,
S.S., Angka, S.L., (Penerjemah). Universitas Indonesia Press. Jakarta.
Scopes, R.K. 1982. Protein Purification: Principles and Practice. Springer-Verlag, New York.
Setijaningsih, L., Gunadi, B., and Umar, C. 2006. Budidaya ikan patin hibrida pada ekosistem pemeliharaan kolam
air tenang. Prosiding Seminar Nasional Ikan. 4:39-144.
Shigemura, Y., Ando, M., Tsukamasa, Y., Makinodan, Y., and KawaI, T. 2003. Correlation of type V collagen content
with post-mortem softening of fish meat during chilled storage. Fisheries Science. 69: 842848.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. IPB, Bogor.
Yoshinaka, R., Sato, M., and Ikeda, S. 1978a. Distribution of collagenase in the digestive organs of some teleost.
Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries. 44(3): 263-267.
Yoshinaka, R., Sato, M., and Ikeda, S. 1978b. Participation of collagenase in the digestion of collagen by rainbow
trout. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries. 44(3): 639-641.
Yuniarti, T., Nurhayati, T., dan Jacoeb, A.M. 2009. Ekstraksi dan karakterisasi kolagenase dari organ dalam bandeng
(Channos channos Forskal). Prosiding Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan
Perikanan: 71-77.

TANYA JAWAB
Tanya : Berapakah konsentrasi standar kolagen yang digunakan?
Jawab : Konsentrasi standar yang digunakan 0,5 mM tanpa regresi linier.

24