Sintesis selektif dan ramah lingkungan dari surfaktan berbasis

lipoaminoacid untuk makanan, menggunakan biokatalis lipase

dan protease yang tidak bergerak

Irfan Azhar Rosyadi 17307141051 | Izha Nur R 17307141066

Cilvia Mega U 17307141068 | Muh. Asmiensyah 17307144022
(Pendahuluan)
 01
Asam lipoamino (LAA) sering dijadikan sebagai amino surfaktan berbasis asam karena toksisitas
rendah dan memiliki kemampuan biodegradasi. LAA diaplikasikan sebagai bahan aditif untuk makanan
karena memiliki sifat pengemulsi.
Metodologi yang digunakan untuk sintesis LAA mencakup reaksi asilasi, esterifikasi, amidasi, dan
alkilasi asam amino. Kelebihan sintesis enzimatik LAA yaitu ringan, strategi yang ramah lingkungan dan
sangat selektif. Sintesis enzimatis membutuhkan pemilihan enzim yang cermat, stabilisasinya dalam
kondisi reaksi dan hasil sintesis yang ditingkatkan sehubungan dengan konvensional metodologi.
Regioselektivitas enzim sangat penting dalam sintesis LAA, karena beberapa reaksi parasit dapat
terjadi yang mengarah ke produk samping yang berbeda.
 02
Strategi yang dapat dilakukan untuk mendorong reaksi transfer asil ion dengan lipase atau
protease yang dapat mempengaruhi selektivitas enzim adalah dengan meningkatkan konsentrasi
pelarut organik dalam media reaksi. Karena banyak enzim labil dalam pelarut organik maka digunakan
enzim yang tidak dapat bergerak karena lebih stabil.
Pada penelitian ini, kinerja dua enzim yang tidak dapat bergerak dalam sintesis lauroyl glisin LAA
dibandingkan dalam hal selektivitas dan hasil ketika enzim ini diimobilisasi pada porous silica
dimodifikasi dengan kelompok fungsional yang berbeda. Enzim yang digunakan adalah protease dari
Bacillus circulans dan lipase dari Pseudomonas stutzeri.
(Metode)
 01 Bahan yang Digunakan

Sodium silikat (25–29% SiO2 dan 7,5–9,5% Na2O),

ethylacetate (EtAc), asam sulfat (98%), dan NaIO4,
cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), NaBH4,
gliserin, glycidyloxypropyltrimethoxysilane (GPTMS
99,7%), trimetoksi(oktil)silan (OTMS; 96%), N-t-BOC-l-
Metode alanin p-nitrofenil ester (BOC-Ala-p-NP), p-nitrofenil
butirat (pNPB), aseton, propilen karbonat, asetonitril,
glisin, asam laurat, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc),
trifluoroacetic acid (TFA) dan triisopropylsilane, Lipase
komersial dan Protease komersial.
 02 Sintesis, modifikasi kimiawi dan
karakterisasi pendukung bersilik
Campuran sodium silikat, setil trimetilamonium
bromida dam etil asetat dipanaskan pada suhu 80C
selama 48 jam. Padatan yang diperoleh dikalsinasi pada
suhu 540C selama 3 jam.
Untuk fungsionalisasi pendukung dengan gugus
glyoxyl atau octylglyoxyl, maka 1,0 g silika (diaktifkan di
bawah vakum pada 200C) dihubungi dengan 30 mL
Metode dari 5% silane yang sesuai, yaitu 3-glycidoxypropyl
methyldiethoxysilane (GPTMS) atau trimetoksi(oktil)silan
(TOS) dalam larutan toluena. Kelompok epoksi dari
kedua pendukung itu dihidrolisis dengan 0,1 M H2SO4
selama 2 jam pada suhu 85C. Setelah penyaringan,
pencucian dengan air/aseton dan pengeringan, oksidasi
dengan 0,1 M NaIO4 larutan diproses selama 2 jam
pada suhu kamar.
 03 Persiapan biokatalis enzim
Pengujian aktivitas enzimatis: Aktivitas enzimatis diukur
dengan peningkatan absorbansi pada 348 nm yang dihasilkan
oleh pelepasan p-nitrofenol dalam hidrolisis 0,4 mM pNPB untuk
lipase, atau 2,5 mM BOC-Ala-p-NP untuk protease, keduanya
dalam buffer natrium fosfat 25 mM pada pH 7,0 dan 25C. Untuk
memulai reaksi, 0,05 mL larutan enzim atau suspensi
ditambahkan ke 2,0 mL larutan substrat.
Metode Imobilisasi protease: Secara singkat, 1 gr glyoxyl-silica (Gx)
dicampurkan dengan 5 mL 100 mM kalium bikarbonat pH 10
yang mengandung Bacilus subtilis enzim pada konsentrasi yang
berbeda (5–30 mg protein per gram pendukung). Suspensi
diinkubasi pada suhu 25C selama 3 jam sampai aktivitas dalam
supernatan konstan. Turunan kemudian direduksi dengan 4 mg
natrium borohidrida, selama 30 menit pada suhu 4C. Akhirnya,
padatan yang diperoleh dicuci bersih dengan air dan disimpan
pada suhu 5C untuk digunakan lebih lanjut.
 03 Persiapan biokatalis enzim

Imobilisasi lipase: Secara singkat, 1 g oktil-glioksil-

silika (OGx) dicampurkan dengan 5 mL 25 mM kalium
fosfat pH 7 yang mengandung enzim (15 mg protein per
gram pendukung). Suspensi diinkubasi pada suhu 250C
selama 6 jam sampai aktivitas dalam supernatan tetap
Metode konstan; setelah itu, suspensi diinkubasi pada pH 10 dan
proses selesai seperti yang telah dijelaskan untuk
imobilisasi dalam glioksilsilika. Akhirnya, padatan yang
diperoleh dicuci bersih dengan air dan disimpan pada
suhu 50C untuk digunakan lebih lanjut.
 04 Karakterisasi biokatalis
Hasil imobilisasi dalam hal protein (IYp) dan aktivitas (IYa)
dihitung menurut Persamaan. (1) dan (2) , masing-masing

dimana Po adalah protein yang ditawarkan, PL adalah protein

yang dimuat di biokatalis, Ao adalah aktivitas yang ditawarkan
Metode dan A adalah aktivitas yang diekspresikan dalam enzim yang
tidak dapat bergerak.
Protein diukur dengan metodologi Bradford dan aktivitas
yang diekspresikan ditentukan seperti yang dijelaskan di atas.
 04 Karakterisasi biokatalis

Stabilitas pelarut: Sediaan enzim diinkubasi pada suhu

450C dalam aseton murni, asetonitril dan propilen karbonat
(semua pelarut mengandung konsentrasi air kesetimbangan,
mendekati 5%).Faktor stabilisasi (SF) didefinisikan, menurut
Persamaan.(3) , sebagai rasio waktu paruh dari enzim yang
tidak dapat bergerak dan bagian yang dapat larut:

Metode
 05 Sintesis lauroyl glisin
Pendekatan enzimatis: Lauroyl glycine disintesis dengan
amidasi glisin dengan asam laurat dalam pelarut yang berbeda:
aseton, asetonitril dan propilen karbonat (semua pelarut dengan
konsentrasi air kesetimbangan, mendekati 5%) pada skala 5-mL
pada reaktor kaca yang tertutup rapat, menggunakan glisin dan
asam laurat dengan rasio 1: 1 M (masing-masing 25 mM) pada
500C dan 250 rpm dalam pengocok orbital. Campuran reaksi
tersebut mengandung 12,5 mg / mL biokatalis. Reaksi diikuti dengan
analisis HPLC yang mengukur hilangnya asam laurat.
Metode Untuk analisis digunakan HPLC, kolom C-18 dan detektor
spektrofotometri UV Vis (model JASCO AS-2089). Lauroyl glycine
yang akan digunakan sebagai standar untuk analisis HPLC
disintesis dengan metodologi fase padat menggunakan glisin
terproteksi dengan 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) yang
memungkinkan memperoleh produk dengan kemurnian dan
kemurnian regio yang diperlukan.
 05 Sintesis lauroyl glisin

Glisin terlindungi dikaitkan dengan resin Rink amida 4-metil

benzhydrylamine (Iris Biotech GmbH) (0,64 mmol / g) dan
dimasukkan ke dalam kontak dengan asam laurat. LAA hasil sintesis
dibelah dengan jalur trifluoroasetat / jalur triisopropilsi / air ultra
murni (95 / 2.5 / 2.5) dan dianalisis dengan HPLC fase terbalik
menggunakan Water Corp XBridge.
TM BEH C18 kolom (100 4,6 mm, 3,5 m m) menggunakan
gradien asetonitril 0-70% dalam air yang mengandung 0,05% TFA
Metode sebagai pelarut A dan asetonitril sebagai pelarut B, dengan laju
aliran 1 mL / menit selama 8 menit. Massa molekul peptida
dikonfirmasi dengan waktu ionisasi desorpsi laser yang dibantu
matriks dari spektroskopi massa penerbangan (MALDI-TOF).
(Hasil)
 01 Preparasi dan karakterisasi biokatalis

Protease diimobilisasi dalam dukungan glyoxyl silica, dengan pembentukan basa Schiff antara
residu lisin dipermukaan enzim dan gugus aldehida pendukung, yang akan menghasilkan peningkatan
stabilitas enzim dan memungkinkan penggunaan kembali biokatalis. Variasi kuantitas protein digunakan
untuk pengoptimalam imobilisasi protease sehingga dihasilkan keseimbangan terbaik anatar protein
yang dimuat dan aktivitas yang terekspresikan (Gambar 1). Kapasitas maksimum pemuatan glioksil
silika yaitu 10 mg protein per gram dukungan, namun aktivitas spesifik tertinggi didapatkan ketika
jumlah protein yang digunakan (ditawarkan) paling rendah yaitu 5mg per gram dukungan. Aktivitas tidak
meningkat secara proporsional dengan protein yang dimuat. Hal yang sama juga terjadi pada peniitian
Wilson dkk pada tahun 2013 yaitu enzim lain yang bergerak disilika dan agarose menunjukkan
hubungan yang sama antara beban protein dan aktivitas yang terkespresikan.
01 Preparasi dan karakterisasi biokatalis

Gambar 1.
Hasil imobilisasi dan aktivitas spesifik protease Bacillus subtilis
diimobilisasi dalam glyoxyl-silica. Aktivitas yang diekspresikan (kotak
penuh) dan protein dimuat (kotak kosong).
 01 Preparasi dan karakterisasi biokatalis
Aktivitas hidrolitik dari lipase dan protease, yang dapat larut dan tidak dapat bergerak, ditentukan
dalam kondisi sintesis LAA yang serupa (Tabel 1). Lipase (larut dan tidak bisa bergerak) lebih aktif
dengan adanya pelarut organik daripada di media air. Kemungkinan karena konfigurasi terbuka (aktif)
mereka distabilkan di media sebelumnya, dan kelarutan substrat dan produk lebih tinggi dalam pelarut
organik. Juga diamati bahwa aktivitas protease lebih tinggi dalam aseton dan asetonitril daripada di
media air (Tabel 1).
Stabilitas enzim terlarut dan tidak bergerak dipelajari dalam kondisi non-reaktif (yaitu dengan tidak
adanya substrat tambahan) dengan adanya pelarut organik, sesuai dengan kondisi yang diperlukan
untuk sintesis LAA: pelarut organik (dengan kesetimbangan konsentrasi air mendekati 5 %) dan suhu
tinggi (45 C untuk aseton dan 55 C untuk asetonitril dan propilen karbonat, Gambar. 2). Hasil
menunjukkan bahwa enzim yang diimibolisasi secara signifikan lebih stabil daripada rekan-rekan
mereka yang dapat larut, seperti yang direfleksikan oleh SF (Tabel 1), tetapi lipase lebih stabil daripada
protease.
01 Preparasi dan karakterisasi biokatalis

Tabel 1
Menampilkan parameter aktivitas dan inaktivasi biokatalis lipase dan protease dalam pelarut organik murni (dengan
konsentrasi air kesetimbangan mendekati 5%).

EA: mengekspresikan aktivitas hidrolitik dalam IU mL-1 untuk enzim terlarut dan IU g-1 dari biokatalis untuk enzim yang
tidak dapat bergerak; SA: aktivitas spesifik per satuan massa protein; t1 / 2: waktu paruh biokatalis pada kondisi yang
ditentukan; SF: faktor stabilisasi pada kondisi yang ditentukan. SF dihitung menurut Persamaan. (1). na : tidak berlaku
untuk parameter tersebut.
01 Preparasi dan karakterisasi biokatalis

Gambar 2.
Stabilitas termal protease (a, b, c) dan lipase (d, e, f) dengan adanya pelarut murni: aseton pada suhu 45
C (a, d), asetonitril pada 55 C (b, e) dan propylene carbonate pada55 C (c, f). Protease bebas (bintang
penuh), protease yang diimobilisasi dalam glioksil silika (lingkaran kosong), lipase bebas (segitiga
penuh), dan lipase yang diimobilisasi dalam oktil-glioksil silika (kotak kosong).
 01 Preparasi dan karakterisasi biokatalis

Stabilitas protease meningkat dengan imobilisasi dalam glioksil silika, yang diharapkan untuk
enzim yang tidak dapat bergerak secara kovalen, karena kekakuan yang lebih tinggi dari protein enzim
di dalam dukungan, sehubungan dengan enzim yang dapat larut dan efek pengurungan di dalam pori-
pori pembawa. Peningkatan serupa dalam stabilitas protease dalam pelarut organik dilaporkan oleh
Ibrahim et al. (2016), menunjukkan bahwa kimia pendukung memainkan peran penting dalam kinerja
biokatalis. SF tertinggi untuk kedua enzim diperoleh dalam asetonitril, sedangkan SF dalam aseton dan
propilen karbonat serupa, tetapi waktu paruh secara signifikan lebih tinggi pada enzim kedua, terutama
untuk lipase (Tabel 1). Hal ini mungkin disebabkan oleh polaritas pelarut dan lingkungan mikro enzim di
dalam penyangga, karena kedua efek tersebut mendukung konservasi lapisan air di sekitar enzim,
yang diperlukan untuk mempertahankan pelipatan protein.
 02 Lauroyl Glycine Synthesis

Bentuk lipase dan protease yang larut dan tidak bergerak merupakan evaluasi dari sintesis lauroyl
glycine. Reaksi ini terjadi selama 48 jam dan produknya dianalisis menggunakan HPLC-MC, dua
senyawa ini dianalisis dengan spektroskopi massa (Gambar 3). Spektrum untuk dipeptida
memperlihatkan hanya terdapat satu puncak molekuler dengan m/z 305 sesuai untuk molekul dipeptida
+ K+, sedangkan spektrum lauroyl glycine menunjukkan dua puncak penting: m/z 275 sesuai untuk
lauroyl glycine + H+ dan m/z 320 sesuai untuk lauroyl glycine + 2Na + H+. Produk tambahan ini dapat
dibentuk dengan komponen fase gerak atau antara fragmen yang sama yang terbentuk selama proses
ionisasi.
02 Lauroyl Glycine Synthesis
03 Enzym Selectivity Toward Lauroyl Glycine
Kromatogram diperoleh setelah 48 jam reaksi dengan enzim terlarut menggunakan aseton
sebagai pelarut, menunjukkan bahwa protease terlarut sangat selektif terhadap lauroyl glycine,
sedangkan lipase terlarut menunjukkan selektifitas yang rendah dalam reaksi sintesis keduanya, luroyl
glycine dan glycylglycine. Immobilisasi menghasilkan perubahan dalam selektivitas lipase, mendukung
sintesis lauroyl glisin menjadi lebih luas dibandingkan dengan enzim yang dapat larut meskipun
hasilnya lebih rendah (Tabel 2). Perubahan selektivitas dan hasil ini dapat dikaitkan dengan efek kimia
permukaan yang mendukung struktur enzim dan kurungan enzim menjadi pori-pori penyangga,
mempengaruhi kinerja katalitik enzim yang tidak bisa bergerak. Efek serupa telah dilaporkan untuk
beberapa lipase yang diimobilisasi dalam silika dan agarose, menunjukkan orientasi enzim penyokong
dapat mempengaruhi perilaku enzim dan dapat bertambah, sebagai contoh, kelebihan enansiomer
saat lipase diimobilisasi dalam penyokong yang sesuai.
 03 Enzym Selectivity Toward Lauroyl Glycine

Di sisi lain tidak ada perubahan signifikan sehubungan dengan selektivitas yang diamati saat
protease diimobilisasi dalam glyoxyl-silica. Hanya sedikit menurun dalam hasil reaksi yang diperoleh
(Tabel 2), yang diharapkan karena jenis imobilisasi ini meningkatkan stabilitas tetapi biasanya dengan
mengorbankan aktivitas. Rasio molar atau rasio konsentrasi Glisin lauroyl : dipeptide (Tabel 2)
ditentukan setelah 48 jam reaksi dengan semua biokatalis dan semua pelarut. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa selektivitas juga dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan karena reaksinya
dipengaruhi oleh polaritas dan viskositas dari medium reaksinya (Tabel 2). Hasil menunjukkan bahwa
selektivitas yang lebih tinggi adalah ketika aseton digunakan sebagai pelarut, terlepas dari biokatalis
yang digunakan. Hasil ini dapat dijelaskan karena aseton merupakan pelarut paling polar di antara yang
dievaluasi (Tabel 2), dan oleh karena itu kelarutan substrat terutama asam laurat adalah yang tertinggi,
selanjutnya telah dilaporkan bahwa pelarut dengan zat antara polaritas seperti aseton mendukung
pergeseran kesetimbangan menuju amidase tanpa mempengaruhi lapisan air di sekitar molekul enzim,
sehingga menghasilkan hasil produk yang lebih tinggi.
 03 Enzym Selectivity Toward Lauroyl Glycine

Di sisi lain, rasio molar lauroyl glycine : glycylglycine yang lebih rendah diukur dengan propilen
karbonat, menunjukkan selektivitas yang buruk diperoleh dengan pelarut ini, kemungkinan karena
viskositasnya yang tertinggi di antara tiga pelarut yang dievaluasi (Tabel 2). Telah dilaporkan bahwa
viskositas media reaksi dapat mempengaruhi perilaku katalitik enzim, mendukung sintesis produk non
alami menggunakan pelarut non konvensional seperti cairan ionik.
Kinetika reaksi diikuti selama 100 jam dengan setiap biokatalis menggunakan aseton sebagai
pelarut (Gambar 5). Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim diimmobilisasi menghasilkan
keseimbangan yang lebih baik antara selektivitas dan hasil daripada rekan-rekan mereka yang dapat
larut. Protease diimobilisasi dalam gloxyl-silika adalah biokatalis berkinerja terbaik yang menghasilkan
40% lauroyl glycine, jauh lebih tinggi daripada yang diperoleh dengan biokatalis lain yang dievaluasi
berada di bawah 25%.
03 Enzym Selectivity Toward Lauroyl Glycine
03 Enzym Selectivity Toward Lauroyl Glycine
(Kesimpulan)
 Hasil penelitian menunjukkan bahwa protease dari Bacillus subtilis,
menunjukkan perilaku katalitik terbaik dalam hal produk hasil dan
selektivitas. Semakin tinggi selektivitas enzim menghasilkan produk yang
lebih murni. Biokatalisis adalah alternatif yang menjanjikan untuk produksi
LAA, ketika kondisi reaksi dioptimalkan, dan baik diaplikasikan dalam
industri makanan dan farmasi.
TERIMAKASIH