Laporan Praktikum Biokimia

NamaPercobaan : E4 Kinetika Enzim: Pengaruh Konsentasi Substrat Pada Reaksi Enzimatis Hari/ Tanggal Percobaan Kelompok Nama Mahasiswa / NRP : Rabu / 12 November 2013 :A : - Lusia pratiwi /2443011176 - Tjoa mey li /2443011092 - Benny wijaya /2443011098 - Ristiana Ayu/2443010087 - Yoseph ola kleden/2443011221 - Felisia Andriyana/2443012039

I.

Tujuan Percobaan - Mengetahui dan memahami pengaruh variasi konsentrasi substrat terhadap reaksi enzimatis - Memahami beberapa parameter kinetika enzim,yaitu Km dan serta maknanya. Vmax

II.

Dasar Teori Amilase adalah sebuah enzim yang mengkatalis pemecahan pati menjadi gula

(yang lebih sederhana). Amilase terdapat dalam air liur manusia, dimana amilase memulai proses kimia dari pencernaan. Makanan yang mengandung banyak pati dan sedikit gula, seperti nasi dan kentang, memiliki rasa sedikit manis ketika dikunyah karena amilase mengubah sejumlah pati yang dikandung oleh nasi dan kentang tersebut menjadi gula di dalam mulut. Enzim dikatakan aktif apabila zat tersebut mempunyai kemampuan untuk melaksanakan aktivitas katalitiknya. Telah dilaporkan oleh Fogarty dan Kelly (1979) bahwa enzim proteolitik bakteri, yeast ataupun fungi mempunyai karakter dan spesifisitas yang berbeda. Karakter enzim proteolitik tersebut ditunjukan dengan pH dan suhu optimum enzim tersebut dalam menghidrolisis substratnya. Selain itu adanya ion logam, asam amino tertentu dan inhibitor enzim akan mempengaruhi aktivitas enzim tersebut (Poernomo et al, 2003).

Pankreas juga memproduksi amilase (alpha amilase) untuk menghidrolisis pati (dari) makanan menjadi disakarida dan trisakarida yang akan dikonversikan untuk enzim-enzim lain menjadi glukosa untuk menyediakan energi bagi tubuh. Tumbuhan dan beberapa bakteri juga memproduksi amilase. Sebagai diastase, amilase merupakan enzim pertama yang ditemukan dan diisolasi (oleh Anselme Payen pada tahun 1833). Amilase spesifik diberi tanda dengan huruf Yunani yang berbeda. Semua amilase merupakan hidrolase glikosida dan bekerja pada ikatan -1,4-glikosidik.

-Amilase -amilase (EC 3.2.1.1) (CAS #9014-71-5) (nama lain: 1,4--D-glukan-glukanohidrolase) merupakan metaloenzim kalsium, yang tidak akan berfungsi total dalam ketiadaan kalsium. Dengan bekerja pada lokasi yang acak sepanjang rantai pati, -amilase memecah rantai-panjang karbohidrat, terutama menghasilkan maltotriose dan maltose dari amylose, atau maltose, glukosa, dan dextrin dari amilopektin. Karena amilase dapat bekerja di bagian manapun dari substrat, amilase cenderung bekerja lebih cepat dibandingkan B-amilase. Pada hewan, amilase merupakan enzim pencernaan utama, dan pH optimumnya adalah 6.7 sampai 7.0. Dalam fisiologi manusia, amilase (yang terkandung dalam) air liur dan pankreas merupakan -amilase. (http://en.wikipedia.org/wiki/Amylase) Bila konsentrasi substrat (S) bertambah, sedangkan keadaan lainya tetap sama, kecepatan reaksi juga akan meningkat sampai suatu batas maksimum V. Pada titik maksimum ini enzim telah jenuh dengan subtrat. Seperti pada gambar. Pada titik-titik A dan B belum semua enzim bereaksi dengan subtrat, maka pada A dan B penambahan subtrat S akan menyebabkan jumlah EnzS bertambah dan kecepatan reaksi v akan bertambah, sesuai dengan penambahan S. Pada titik C semua enzim telah bereaksi denagn subtrat, sehingga penambahan S tidak akan menambah kecepatan reaksi, karena tidak ada lagi enzim bebas. Pada titik B kecepatan reaksi tepat setengah kecepatan maksimum. Konsentrasi subtrat yang menghasilkan setengah kecepatan maksimum dinamakan harga Km atau konstanta

Michaelis.(Indah, 2004).

III.

Alat dan Bahan

Alat: Spektrofotometer Kuvet Stopwatch Penangas air terkontrol Tabung reaksi Pipet volume Mikropipet Rak tabung reaksi Vortex

Bahan: Larutan ekstrak kasar enzim amilase (dikondisikan selalu dingin, dalam penangas es) Larutan pati 2,0% (w/v) Larutan penyangga 0,04 M pH 4; 5; 6,5; 8; dan 10 Larutan iodine Larutan HCl 0,1 M LarutanNaCl 1% Larutan HgCl2 1% LarutanPb(CH3COO)2 1%

Preparasi larutan kerja iodine (dibuat baru): encerkan 1,0 mL larutan stock (500 mg iodine/I2 dan 5,0 g KI / 100 mL air) 100 x. Simpan dalam botol gelap. Preparasi larutan pati 1,0% (w/v): larutan pati 2,0% (w/v) diencerkan 1:1 dengan larutan penyangga 0,04 M pada pH optimum yang telah ditentukan dari percobaan minggu sebelumnya. Larutan pati juga perlu dibuat baru setiap hari.

IV.

Cara Kerja 1. Tahap awal

Lakukan pengujian awal terhadap aktivitas enzim untuk menentukan pengamatan (uji selektivitas) serta konsentrasi / jumlah enzim yang diperlukan untuk reaksi enzimatis yang menghasilkan A diantara 0,2 - 1,5.

Reaksi ini akan menghasilkan warna biru dengan Amax pada 620 nm.

2. Metode pengujian aktivitas amilase (metode Birds dan Hopkins dalam Yoo et al; 1987) Pembuatan pati X % Pati 2% Pati 1% Pati 0,5% Pati 0,25% Pati 0,125% 8 ml 4 ml 2 ml 1 ml 8 ml 12 ml 14 ml 15 ml Dapar pH 6,5 %

Sediakan tiga buah tabung reaksi bersih, satu tabung untuk R (pembanding tanpa enzim), dan dua tabung untuk AE (aktivitas enzim, replikasi = 2).

Dengan pipet volume 5 mL atau mikropipet 1000 L, tambahkan 5,00 mL larutan pati konsentrasi uji (w/v) dalam pH optimasi pada tabung R dan AE, dan suhu optimum selama 10 menit.

Tambahkan pada tabung reaksi AE 500 L larutan enzim, sedangkan pada tabung R 400 L air suling, cata waktu sebagai t=0, vortex sebentar, suhu uji selama 10 menit.

Setelah tepat 10 menit, segera tambahkan 5,00 mL HCl 0,1 N untuk menghentikan reaksi, vortex sebentar.

Pipetlah 500 L masing-masing campuran ke dalam tabung reaksi yang berisi 5,00 mL larutan kerja iodine dan vortex.

Amati intensitas warna biru larutan dengan spektrofotometer pada 620 nm.(A0)
Blangko ; 5 ml larutan kerja Iodin + 500l Hcl 0.1 N

Untuk E ( Menandakan adanya Enzim ) : 1.Pipet 5 ml pati X % ke tabung reaksi,tambakan 400l larutan enzim,catat waktu sebagai t=0, vortex diamkan 10 menit 2.Untuk bagian 2 dan 3 dijadikan sebagai R 4.Ukur A pada 620 nm Hitung Km dan Vmakx dengan menggunakan persamaan Lineweaver Burk : 1 = Km V Vmax 1 S + 1 Vmax

IV.Hasil Pengamatan Pati 1 % A A0 -0,015 2,958 Pati 0,5 % -0,003 1,682 Pati 0,25 % -0,016 1,132 Pati 0,125 % -0,001 0,481

1-A/A0

1,005

1,0017

1,01413

1,002

AE= D(1-A/A0)F V=AE/t

125,62

62,93

31,69

15,656

12,562

6,293

3,169

1,565

I/V

0,0796

0,1589

0,3155

0,639

125

62,5

31,25

15,625

Persamaan Michaelis-MentenVO= Vmax(s)/ Km + (s) Persamaan Lineweaver Burk1/Vo=Km/Vmax.(1/s)+(1/Vmax)

1/Vo=Y

,Km/Vmax

=b

,1/S

,1/Vmax

1/S 1 2 4 8 0,082 0,163 0,349 0,736

1/Vo

Maka didapatkan, a : -0,02 b :0,094 r :0.999

Hasil Pengamatan sebenarnya : SUBSTRAT X=1/S Ao A 1-(AAo) Pati 1 % Pati 0,5 % Pati 0,25 % Pati 0,125 % 1 2 4 8 2,108 1,459 0,733 0,412 0,052 0,033 0,060 0,054 0,9754 1 0,9774 1 0,9182 1 0,869 1 125 62,5 31,25 D F D(1A.Ao)F 121,925 10 61,08 28,69 10 10 10 t Vo=D(1- Y=1/Vo A/Ao)F/t 12,19 6,10 2,86 1,3578 0,082 0,163 0,349 0,736

15,625 13,578

V.

Pembahasan Dari hasil yang kami peroleh melalui percobaan, didapat aktivitas enzim

dibawah pengaruh konsentrasi substrat yang kami dapatkan menurut kami sesuai, karena memiliki perbandingan yang cukup sesuai dengan konsentrasi substrat dari kelompok lain.Km/Vmax =0,094 , 1/ Vmax =-0,02 Jawaban dari Bahan Diskusi / Pembahasan 1. Jelaskan apa makna nilai Km dan Vmax suatu enzim? Jawab: Vmax, pada kondisi optimum enzimatis amilase dapat mengubah substrat amilum menjadi glukosa dalam ppm per menit. Km, jumlah molekul substrat yang dapat di tangani oleh satu tapak aktif per detik. 2. Parameter kcat menyatakan jumlah substrat yang dapat diubah (turned over) per detik, disebut juga sebagai turn over number (satuan kcat = s-1) a. Bagaimana cara menentukan parameter ini (cari persamaannya). b. Berdasarkan persamaan tersebut, jelaskan data apakah yang perlu dilengkapi serta metode apa saja yang dapat digunakan untuk memperoleh data tersebut. c. Jawab: k3 = kcat
[ ] [ ] [ ][ ] [ ]

[ ][ ]

3.

Deskripsikan mengenai pengaruh konsentrasi substrat terhadap reaksi enzimatis. Jawab : Bila konsentrasi substrat (S) bertambah, sedangkan keadaan lainya tetap sama, kecepatan reaksi juga akan meningkat sampai suatu batas maksimum V. Pada titik maksimum ini enzim telah jenuh dengan subtrat. Seperti pada gambar. Pada titik-titik A dan B belum semua enzim bereaksi dengan subtrat, maka pada A dan B penambahan subtrat S akan menyebabkan jumlah Enzim S bertambah dan kecepatan reaksi v akan bertambah, sesuai dengan penambahan S. Pada titik C semua enzim telah bereaksi denagn subtrat, sehingga penambahan S tidak akan menambah kecepatan reaksi, karena tidak ada lagi enzim bebas. Pada titik B kecepatan reaksi tepat setengah kecepatan maksimum. Konsentrasi subtrat yang menghasilkan setengah kecepatan maksimum dinamakan harga Km atau konstanta

VI.

Kesimpulan

Bila konsentrasi substrat (S) bertambah, sedangkan keadaan lainya tetap sama, kecepatan reaksi juga akan meningkat sampai suatu batas maksimum V. Pada titik maksimum ini enzim telah jenuh dengan subtrat. Seperti pada gambar. Pada titik-titik A dan B belum semua enzim bereaksi dengan subtrat, maka pada A dan B penambahan subtrat S akan menyebabkan jumlah EnzS bertambah dan kecepatan reaksi v akan bertambah, sesuai dengan penambahan S. Pada titik C semua enzim telah bereaksi denagn subtrat, sehingga penambahan S tidak akan menambah kecepatan reaksi, karena tidak ada lagi enzim bebas. Pada titik B kecepatan reaksi tepat setengah kecepatan maksimum. Konsentrasi subtrat yang menghasilkan setengah kecepatan maksimum dinamakan harga Km Activator dan inhibitor memiliki peran dalam kerjas uatu enzim, yang akan berpengaruh terhadap hasil reaksi enzimatis yang terbentuk. NaCl berperan sebagai activator, HgCl2 dan

Pb(CH3COO)2berperan sebagai inhibitor pad areaksi enzimatis amylase terhadap amilum.

VII.

Daftar Pustaka

1. http://en.wikipedia.org/wiki/Amylase^ 2. Henri, Victor (1903). Lois Gnrales de lAction des Diastases. Paris: Hermann. Google books (US only) 3. "Victor Henri". Whonamedit?. Retrieved 24 May 2011. 4. Michaelis, L.; Menten, M.L. (1913), "Die Kinetik der Invertinwirkung", Biochem Z : 333369 (recent translation, and an older partial translation)