ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian mengenai pemurnian enzim lipase dari bakteri lokal yang
diisolasi dari air laut Pelabuhan Panjang. Proses pemurnian enzim dilakukan secara bertingkat
dari ekstrak kasar, pemurnian dengan amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kolom. Hasil
penelitian memperlihatkan bahwa proses pemurnian enzim dengan amonium sulfat, dialisis, dan
kromatografi kolom meningkatkan aktivitas spesifik dari 0,059 U/mg untuk ekstrak kasar enzim
menjadi 2,011 U/mg untuk fraksi amonium sulfat, 4,86 U/mg untuk dialisis dan 4,96 U/mg
untuk hasil kromatografi kolom dengan tingkat kemurnian 84,07 kali. Enzim lipase hasil
pemurnian memiliki karakteristik aktivitas optimum pada pH 8, temperatur 45°C, dan waktu
inkubasi 10 menit dengan nilai KM = 0,07 mg substrat/ml dan Vmaks = 1,506 µmol minyak /ml
enzim.menit. Enzim lipase yang didapat digunakan untuk mengkatalisis reaksi esterifikasi asam
laurat dengan alkohol. Dari hasil pengamatan yang dilakukan aktivitas esterifikasi enzim lipase
juga mengalami peningkatan seiring dengan bertambahnya kemurnian enzim yaitu dari 2,38
mmol/ml enzim.menit untuk ekstrak kasar, menjadi 3,81 mmol/ml enzim.menit untuk fraksi
amonium sulfat, selanjutnya meningkat kembali menjadi 4,29 mmol/ml enzim.menit untuk
dialisis dan 5,24 mmol/ml enzim.menit untuk hasil kromatografi kolom.
1. PENDAHULUAN
Enzim adalah golongan protein yang disintesis oleh sel hidup dan mempunyai fungsi
penting sebagai katalisator dalam setiap reaksi metabolisme yang terjadi pada organisasi hidup.
Enzim juga merupakan biokatalisator yang menunjang berbagai proses industri. Hal ini
disebabkan enzim mempunyai efisiensi dan efektifitas yang tinggi, reaksinya tidak
menimbulkan produk samping, serta dapat digunakan berulangkali dengan teknik amobilisasi
(Lehninger, 1995)
Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi, perlu
diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis substrat
yang digunakan. Kondisi pertumbuhan yang menunjang produksi enzim secara maksimal adalah
pH, suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus mengandung
sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral (Wang, 1979).
Pengunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang secara cepat. Banyak
industri-industri yang telah memanfaatkan kerja enzim, meliputi industri pangan dan non
pangan. Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada bandingan dalam
pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase. Enzim ini memiliki sifat khusus dapat
memecahkan ikatan ester pada lemak dan gliserol. Selain itu, lipase mempunyai kemampuan
mengkatalis reaksi organik baik didalam media berair maupun dalam media non air (Sumarsih,
2004). Enzim lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda minyak
pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air. Beberapa reaksi yang dikatalisis oleh
enzim lipase diantaranya adalah reaksi hidrolisis, alkoholisis, esterifikasi,dan interesterifikasi
(Dosanjh dan Kaur, 2002).
Disamping dari tanaman dan hewan, dewasa ini lipase mulai diproduksi dari berbagai
mikroorganisme. Keuntungan memproduksi enzim dari mikroorganisme menurut Suhartono
(1989) adalah produksi enzim dapat ditingkatkan dalam skala besar dalam ruangan yang relatif
terbatas. Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim lipase,
karena bakteri memiliki kemampuan hidup di berbagai lingkungan yang terdapat kandungan
makanan atau nutrisi yang kompleks. Bakteri isolat lokal yang digunakan pada penelitian ini
terbukti mampu menghasilkan enzim lipase. Bakteri ini diperoleh dari air laut Pelabuhan
Panjang, Telukbetung Selatan, Bandar Lampung. Bakteri ini memiliki pertumbuhan optimum
yaitu pada temperatur 35ºC, waktu inkubasi 24 jam, pH 8, dan dengan komposisi media
fermentasi 10% minyak zaitun, 1% pepton, dan 5% gum arab.
Dalam penelitian ini dilakukan pemurnian enzim lipase dan diuji aktivitasnya serta
ditentukan karakternya. Enzim lipase yang didapat selanjutnya diaplikasikan untuk
mengkatalisis reaksi esterifikasi asam laurat dengan alkohol.
2. METODE PENELITIAN
larutan NaOH 0,05N dan 0,1N, sephadex G-100, buffer fosfat pH 8, Na2CO3, CuSO4.5H2O, Na-
K Tartarat, Reagen Folin Ciocalteau, cupric asetat 5% pH 6-6,2, larutan BSA, asam laurat,
lauril alkohol dan heksan.
b. Dialisis
Endapan enzim hasil fraksinasi bertingkat yang memiliki aktivitas tertinggi dilarutkan ke
dalam buffer fosfat pH 8; 0,05 M selanjutnya dimasukkan kedalam kantong selofan, kemudian
didialisis menggunakan buffer fosfat pH 8; 0,05 M selama ± 48 jam pada suhu 4ºC.
c. Kromatografi Kolom
Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan kolom
kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100 sebagai fase diam.
Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang berfungsi sebagai fase
diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak. Sampel enzim yang
memiliki bobot molekul lebih besar dari pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori
sehingga akan lebih dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil
akan masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih lambat. Setelah proses kolom
berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15 ml. Eluen yang telah ditampung pada
wadah kemudian diukur kadar protein dan aktivitas enzimnya. Fraksi yang memberikan
aktivitas tinggi dikumpulkan dan dikarakterisasi serta ditentukan aktivitas esterifikasinya.
b. Penentuan pH optimum
Untuk mengetahui pH optimum dari enzim yang telah dimurnikan, dilakukanpengukuran
aktivitas enzim dengan menggunakan variasi nilai pH (6, 7, 8, 9 dan 10)
Untuk penentuan standar dilakukan dengan komposisi campuran yang sama, tetapi pada
saat dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran aseton : etanol untuk
menginaktifkan enzim. Kemudian dititrasi dengan prosedur yang sama dengan analisis sampel.
1. pH Optimum
Untuk menentukan pH optimum enzim hasil isolasi, variasi pH yang digunakan adalah 6, 7,
8, 9, dan 10 hasilnya tertera pada Gambar 1. Dari gambar tersebut terlihat bahwa aktivitas lipase
bervariasi dengan adanya perubahan pH. Hal ini umumnya terjadi karena adanya perubahan
struktur sekunder dan tersier dari enzim. Pada pH yang optimum muatan gugus samping asam
amino berada pada keadaan yang sesuai sehingga enzim sangat efisien dalam mempercepat
reaksi biokimia yang sangat spesifik. Aktivitas optimum lipase dicapai pada pH 8. Hal ini
disebabkan karena pada kondisi pH 8 gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada
sisi katalitik enzim berada pada keadaan yang diinginkan sehingga aktivitas katalitiknya tinggi.
Aktivitas Unit (U/ml)
0.2
0.15
0.1
0.05
00
5 6 7 8 9 10 11
Gambar 1. Penentuan
pH pH Optimum
2. Temperatur Optimum
Gambar 1. Penentuan pH Optimum
Pada penentuan temperatur optimum, suhu yang digunakan adalah 30°C, 35°C, 40°C,
45°C, dan 50°C. Dari hasil pengujian yang dilakukan temperatur optimum lipase adalah 45°C
seperti yang tertera pada Gambar 2. Pada temperatur kurang dari 45°C enzim cukup stabil,
tetapi hidrolisis substrat minyak zaitun oleh enzim tidak berjalan secara maksimal. Dengan
meningkatnya temperatur, energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi bertambah sehingga
molekul yang bereaksi semakin banyak dan produk yang dihasilkan semakin besar. Diatas
temperatur optimum, aktivitas enzim menurun tajam hal ini terjadi karena enzim mengalami
denaturasi protein yang dapat merubah konformasi struktur molekul sehingga enzim kehilangan
sifat alamiahnya. Pada temperatur tinggi, substrat juga dapat mengalami perubahan konformasi
sehingga gugus reaktifnya mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim (Suhartono,
1989). Sedangkan pada suhu yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim juga rendah.
Hal ini disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia. Energi tersebut dibutuhkan
untuk menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif, baik dari molekul enzim atau molekul
substrat.
0.25
0,6
0,4
0,2
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Waktu (menit)
Berdasarkan pada Gambar 3, aktivitas lipase optimum pada waktu inkubasi 10 menit.
Pada waktu inkubasi diatas 10 menit, enzim mulai mengalami penurunan aktivitas lipase. Hal
ini dapat disebabkan adanya perbedaan waktu yang dibutuhkan oleh setiap enzim untuk bereaksi
dengan substrat. Selain itu dengan panas 45°C enzim lipase tidak dapat terlalu lama bereaksi
dengan substrat sehingga lipase mulai mengalami denaturasi.
4. Nilai Km dan Vm
Kecepatan reaksi enzim akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi
substrat sampai pada suatu harga yang memberikan kecepatan reaksi tetap. Pada keadaan
tersebut, kecepatan reaksi enzim mencapai maksimum karena reaksi enzim dengan substratnya
menjadi jenuh dan tidak dapat bereaksi lebih cepat. Harga KM dari suatu enzim berfungsi untuk
mengetahui konsentrasi dari substrat yang menghasilkan setengah laju reaksi maksimum.
Dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa mula-mula aktivitas unit meningkat dengan
bertambahnya konsentrasi substrat, akan tetapi setelah tercapai aktivitas optimum terjadi
penurunan aktivitas. Hal ini dikarenakan pada konsentrasi substrat optimum enzim berada pada
keadaan “jenuh dengan substrat”. Selain itu, dapat juga disebabkan pengendalian umpan balik,
dimana jika produk yang dihasilkan berlebih maka produk tersebut menjadi inhibisi bagi kerja
enzim.
12
Aktivitas Unit (U/ml)
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5
Gambar 4. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas lipase
Konsentrasi Substrat (%)
Harga KM dihitung dengan mengukur aktivitas enzim lipase dalam berbagai konsentrasi
substrat dengan pH, temperatur, dan waktu inkubasi optimum. Pada penelitian ini digunakan pH
8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit. Harga KM enzim hasil isolasi adalah 0,07 mg
substrat/ml dan Vmaks sebesar 1,506 µmol minyak/ml enzim.menit.
enzim hasil kromatografi kolom. Dari hasil penelitian diperoleh data bahwa aktivitas esterifikasi
meningkat dari ekstrak kasar enzim sampai tahap pemurnian kromatografi kolom seperti yang
terlihat pada Tabel 1.
Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa aktivitas esterifikasi dari ekstrak kasar sampai dengan
kromatografi kolom semakin meningkat. Hal ini dapat disebabkan semakin meningkat
kemurnian enzim lipase maka makin meningkat juga aktivitas esterifikasi enzim lipase.
Adanya protein lain yang bukan enzim dapat menghambat sehingga kerja enzim tidak maksimal
dalam proses esterifikasi. Maka ketika dilakukan pemurnian, enzim telah terpisah dari protein
lain yang bukan enzim sehingga dapat memaksimalkan proses esterifikasi.
4. KESIMPULAN
UCAPAN TERIMAKASIH
DAFTAR PUSTAKA
Annisa, Y. 2006. Studi Penentuan Aktivitas Enzim Lipase dari Bakteri Proteus vulgaris Galur
Lokal PP-1 dengan Metode Spektrofotometri UV-VIS dan Metode Titrimetri. Skripsi
Sarjana Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Basri, M., Ampon, K., Wan Yunus, W.M.Z., Razak, C.N.A., dan Saleh, A.B 1995. Enzymic
Synthesis of Fatty Esters by Hydropobic Lipase Derivates Immobilized on Organic
Polymer Beads. JAOCS 72(4):407-411.
Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A
Lipase From Bacillus sp. Journal Biotechnology and Applied Biochemistry. Vol. 36.
Hlm 7-12. Punjab University. Chandigarh.
Efendi, S. 2001. Karakterisasi Enzim Lipase Intraseluler dengan Aktivitas Esterifikasi dari
Kpaang Rhizopus oryzae TR 32. Tesis. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian
Bogor. Bogor.
Nuraida, L. 2000. Eksplorasi, Karakterisasi dan Produksi Lipase dengan aktivitas Esterifikasi
Tinggi dari Kapang Indigenus. Laporan Tahunan Pertama Penelitian Hibah Bersaing
VIII/I Perguruan Tinggi. FATETA-IPB. Bogor.
Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan
Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih. JIPTUNAIR. Surabaya.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU Bioteknologi IPB. Bogor.
Suhendra, L., Trenggono, Hidayat, C. 2004. Aktifitas Hidrolisis dan Esterifikasi Lipase Ekstrak
Kecambah Biji Wijen (Sesamun Indicum). Prosiding Seminar Nasional dan Kongres
Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia (PATPI). Jakarta, 17-18 Desember
2004.
Wang, I.C. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and Sons. New York.