ACARA IV

PENGUJIAN AKTIVITAS ENZIM DENGAN FLUORESCEIN DIACETAT (FDA)

HYDROLYSIS ASSAY
Abstraksi
Enzim merupakan biomolekul yang dapat mempercepat (katalis) reaksi kimia yang disebut
reaksi enzimatis dimana substrat akan diubah menjadi molekul lain yang disebut produk. Hampir
seluruh proses metabolisme makhluk hidup membutuhkan enzim untuk mempercepat reaksi sehingga
dapat mempertahankan kehidupan. Pengujian aktivitas enzim suatu mikroorganisme air dilakukan
dengan FDA hydrolysis assay dimana digunakan substrat fluorescein diacetat. Hasil pengujian
didapatkan untuk sampel air selokan, air sawah dan air laut menghasilkan fluorescein sebesar -0.0067
g/mL, -0.00657 g/mL dan -0.0068 g/mL sehingga dapat disimpulkan tidak terdapat fluorescein
yang dihasilkan dan seluruh sampel air tidak memiliki mikroorganisme yang memiliki enzim untuk
memotong FDA.
Kata kunci: Enzim, aktivitas enzim, FDA assay.

I.

Pendahuluan

a. Latar Belakang
Metabolisme merupakan suatau reaksi kimia yang terjadi didalam tubuh makhluk
hidup. Reaksi metabolisme yang terjadi dilakukan untuk memperoleh energi, menyimpan
energi, memproduksi atau memecah suatu zat dan memasukkan atau mengeluarkan zat zat.
Tentunya dalam suatu reaksi kimia terdapat suatu energi untuk memulai hingga mengakhiri
proses tersebut terjadi. Pada makhluk hidup hidup dikenal adanya suatu biomolekul yang
dapat melakukan kinerja katalisator yang disebut enzim.
Keberadaan enzim membantu makhluk hidup dalam menjalankan kehidupannya.
Adanya proses evolusi menjadikan enzim memiliki kemampuan yang optimal untuk setiap
organisme tertentu. Pada umumnya enzim tersusun atas protein dan molekul lainnya
(anorganik maupun organik). Kinerja enzim banyak dipengaruhi berbagai macam faktor.
Faktor tersebut dapat membantu kinerja enzim atau dapat menurunkan aktivitas enzim hingga
menghilangkan aktivitas enzim.
Kondisi lingkungan yang berbeda mempengaruhi enzim yang dihasilkan serta
kemampuan yang dimiliki enzim tersebut. Hal tersebut pada dasarnya sebagai kemampuan
bertahan diri dari suatu kondisi lingkungan. Seperti pada mikroorganisme pada kondisi
ekstremofil yang dapat menghasilkan enzim yang dapat tahan pada kondisi yang ekstrem
contohnya enzim DNA polimerase. Kemampuan enzim tersebut dimanfaatkan untuk

digunakan dalam proses PCR dimana proses tersebut menggunakan suhu tinggi contoh enzim
tersebut seperti Taq polymerase, Pfu polymerase dan lain-lain (Chandrasekaran and Kumar,
2011).
b. Tujuan
1. Mengetahui metode perhitungan aktivitas enzimatik
2. Mengetahui aktivitas enzimatik mikroorganisme pada air laut, air selokan dan air sawah.

II.

Tinjauan Pustaka

Enzim merupakan molekul yang dapat mempercepat (katalis) reaksi kimia. Reaksi
yang terjadi disebut reaksi enzimatis dimana substrat akan diubah menjadi molekul lain yang
disebut produk. Hampir seluruh proses metabolik membutuhkan enzim untuk mempercepat
reaksi sehingga dapat mempertahankan kehidupan. Seperti yang telah diketahui
mikroorganisme memiliki kemampuan dalam memproduksi berbagai macam enzim. Enzim
yang dihasilkan dapat berupa eksoenzim maupun endoenzim, eksoenzim merupakan enzim
yang dapat dibawa keluar sel atau berfungsi diluar sel sedangkan endoenzim berfungsi
didalam sel. Adanya eksoenzim memungkinkan mikroorganisme untuk merombak terlebih
dahulu suatu substrat sebelum diserap melalui membran sel yang selanjutnya digunakan
dalam proses metabolisme (Black, 1999).

Enzim diketahui dapat mengkatalis lebih dari

5.300 tipe reaksi biokimia. Enzim kebanyakan berupa protein akan tetapi beberapa enzim
berupa RNA molekul. Seperti sifat katalis, enzim dapat meningkatkan reaksi dengan
mengurangi energi aktifasi. Enzim pada organisme multiselular (mamalia atau tanaman)
memiliki sifat yang spesifik dengan keberadaan pada bagian tubuh tertentu, organ atau
jaringan tertentu (Schomburg et.al., 2013).
Enzim adalah biomolekul yang tersusun atas protein dam ko-faktor. Pada umumnya
enzim berbentuk bulat seperti protein lainnya enzim juga tersusun atas rantai asam amino
linear yang kemudian melipat dan membentuk struktur tiga dimensi. Susunan asam animo
mempengaruhi struktur dan aktivitas enzim tersebut dalam melakukan proses katalisasi
(Anfinsen, 1973). Struktur enzim dapat terdenaturasi ketika terkena panas dan zat kimia
pendenaturasi (asam kuat atau basa kuat). Enzim yang telah terdenaturasi akan hilang
kemampuannya (Petsko and Ringe, 2003).
Kemampuan enzim terletak pada bagian pada sisi aktifnya yaitu berupa bagian
pengikatan dimana enzim hanya dapat mengikat substrat tertentu saja dan bagian katalisasi

yang akan melakukan suatu reaksi kimia. Pada bagian tersebut hanya terdiri dari struktur
yang kecil berkisar 2-4 asam amino. Asam amino lainnya berfungsi dalam menjaga bentuk
sisi aktif. Asam amino pada umumnya tidak berperan secara langsung terhadap proses
katalisasi akan tetapi kofaktor yang berperan (Suzuki, 2015).
Enzim harus mengikat substrat terlebih dahulu sebelum melakukan katalisasi. Substrat
yang terikat hanya substrat tertentu saja. Hal tersebut disebabkan enzim memiliki sifat lock
and key dimana sisi pelekatan memiliki bentuk yang spesifik dan hanya substrat sesuai
dengan sisi pelekatan yang dapat melekat. Akan tetapi teori tersebut telah disempurnakan
dengan induced fit model (Daniel Koshland, 1958) dimana sisi aktif suatu enzim bersifat agak
lentur/ fleksibel. Sehingga saat substrat ingin melekat pada sisi aktif, sisi tersebut akan
mengalami perubahan hingga sesuai dengan substrat tersebut (Vasella et.al., 2002).
Proses evolusi yang menjadikan optimalisasi enzim untuk selektif dan effesien dalam
katalisasi reaksi biokimia. Data terbaru menunjukan adanya peningkatan enzim dalam
melakukan siklus kataliknya dengan penikatan substrat, transformasi kimia dan produk yang
dihasilkan. Pada umumnya kemampuan katalisasi enzim terjadi dengan kemampuan enzim
dalam menstabilisasi keadaan transisi , mengurangi pembatas reaktan sehingga dicapainya
bagian produktif. Enzim dalam melakukan kinerjanya memerlukan waktu terlama untuk
membantu reaktan hingga bagian transisinya. Sehingga enzim akan mengoptimalkan dalam
proses pelekatan substrat,reaksi kimia dan menghasilkan produk (Ma and Nussinov, 2010).

III.

Metodologi

Praktikum mikrobiologi air acara IV berjudul Pengujian Aktivitas Enzim dengan

Fluorescein diacetat assay (FDA) Hydrolysis Assay dilaksanakan pada tanggal 9 Maret
2015. Praktikum dilaksanakan pada Labolatorium mikrobiologi umum dengan alat dan bahan
yang dipergunakan yaitu sampel air, buffer fosfat, medium TSA, fluorescein diacetat,
kloroform:methanol (2:1), tabung falcon, tabung kimax, kertas filter, spektofotometer,
sentrifuse, vortex, cawan petri, pinset, mikropipet, tip, milipore filtration dan vacuum
manifold. Sampel air yang dipergunakan berasal dari air sawah, laut dan selokan.
Cara pengerjaan diawali dengan persiapan sampel uji dengan meletakan kertas filter
pada milipore filtration, kemudian dilakukan penyaringan dengan dimasukannya sampel air
pada cup milipore bagian atas kemudian disedot dengan bantuan vacuum manifold. Kertas
filter yang telah digunakan diambil dengan pinset dan dimasukan kedalam cawan petri yang

telah diisi medium TSA kemudian diinkubasi selama 1-2 jam (masing-masing sampel dibuat
2 ulangan). Kemudian dilakukan pengujian FDA dengan disiapkan 7 tabung falcon yang telah
dimasukan kertas filter sebelumnya. Buffer fosfat kemudian ditambahkan sebanyak 20 mL
dan FDA sebanyak 0.1 mL. Inkubasi pada suhu 30oC selama 30-60 menit kemudian
ditambahkan kloroform:metanol (2:1) 20 mL. Sentrifugasi tabung (5000 x g) selama 5 menit
kemudian supernatant 5 mL diambil pada setiap tabung falcon dan hitung nilai OD 490 dengan
digunakannya spektofotometer. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan digunakannya
campuran buffer fosfat dan fluorescein pada tabung kimax. Perbandingan campuran
fluorescein dan buffer fosfat sebesar 0 L : 1000 L, 250 L : 750 L, 500 L: 500 L, 750
L : 250 L dan 1000 L : 0 L. Larutan setiap tabung kemudian diambil 4 mL dan dihitung
nilai OD490 dengan spektofotometer serta tentukan persamaan linier y = ax + b dari kurva
yang dihasilkan. Selanjutnya persamaan tersebut digunakan untuk penentuan larutan
fluorescein yang terhidrolisis oleh aktivitas enzim dari mikroorganisme sampel air yang diuji.

IV.

Hasil dan Pebahasan

a. Hasil
Tabel 1. Fluorescein yang dihasilkan dari masing-masing sampel air
Sampel
Air sawah
Air laut
Air selokan

Konsentrasi Fluorescein
-0.00657 = 0
-0.00682 = 0
-0.00666 = 0

OD
3
f(x) = 124.21x + 0.87
R = 0.54

2
Nilai OD

OD
Linear (OD)

1
0
0

0.01 0.01 0.02 0.02

Konsentrasi

Grafik 1. Kurva standar

b. Pembahasan
Fluorescein diacetate (FDA) hydrolysis assay merupakan salah satu metode untuk
mengetahui aktifitas suatu enzim pada populasi mikrobia dan dapat digunakan untuk
memperkirakan keseluruhan aktiitas mikrobia pada sampel suatu lingkungan. Pengujian ini
tidak spesifik dikarenakan sifatnya yang sensitive terhadap aktifitas beberapa enzim seperti
lipase, esterase dan protease. Pengujian menggunakan FDA dilakukan dengan mencampur
sampel dengan FDA dan buffer kemudian diinkubasi selama 1-2 jam.
Prinsip kerja pengujian FDA dengan menghaslkan molekul fluorescein bewarna
kuning kehijauwan akibat adanya aktifitas enzim yang memotong molekul FDA. Kuantitas
enzim kemudian dapat diketahui dengan mengukur intesitas warna yang didapat dengan
spektofotometer. Pengujian dengan metode FDA tidak umum dilakukan untuk pengujian
sampel air akan tetapi dengan suatu modifikasi dapat dipergunakan untuk menganalisis
sampel air. Penggunaan prosedur filtrasi untuk mendapatkan bakteri pada suatu membran dari
suatu air. Sampel air dilakukan filtrasi dengan filter berpori-pori berukuran 0.45 m. Filter
yang telah digunakan akan terdapat bakteri pada sampel air kemudian dilakukan pengujian
FDA.
Tahap-tahap yang dilakukan dalam pengujian FDA dengan sampel air tidak jauh
berbeda dengan sampel tanah. Perbedaan yang dilakukan hanya pada sampel air dilakukan
filtrasi, filtrasi dilakukan dengan menggunakan filter milipore, vakum manifold, dan forsep
steril. Filter yang digunakan berpori-pori berukuran 0.45 m dengan diameter 47 mm dan
berupa membran polikarbon. Proses kerja diawali dengan mensterilisasi forsep dengan
ethanol 70% dan dilewati pada api bunsen. Fakum manifold kemudian disusun dengan
meletakan filter diantara tabung. Pada wadah/ cup teratas air sampel dimasukan hingga 100
mL (batas maksimum). Hubungkan selang tabung bagian bawah dengan pompa vakum
kemudian fakum dihidupkan. Air akan terisap dan melewati membran filter sehingga
mikroorganisme yang berada dalam air akan terjebak pada membran. Tutup seluruh katup
jika masih terdapat air yang belum terisap. Cup kemudian dilepas dan filter diambil
menggunakan forsep steril. Membran filter dimasukan kedalam tabung falcon steril yang
kemudian dilakukan pengujian FDA. Proses filtrasi dilakukan secara aseptis agar tidak
terdapat kontaminasi jasad lain (bukan dari sampel). Filtrasi dengan membran filter tersebut
dapat melewati air tanpa ikut terbawanya mikroorganisme (ukuran E.coli 2m (Anonim,
2002). Filtrasi perlu menggunakan bantuan vakum agar air sampel mudah terserap dan lebih
cepat, serta vakum yang digunakan harus sesuai sehingga tidak terlalu kuat yang dapat

merusak membran filter atau terlalu lemah sehingga tidak membantu air untuk melewati
filter.
Penumbuhan isolat pada membran filter sebelum dimasukan kedalam tabung falcon
memungkinkan dilakukan. Penumbuhan berguna untuk menambah jumlah isolat agar
aktivitas enzim mikroorganisme tersebut cukup dalam pengujian FDA. Penumbuhan dapat
dilakukan pada media TSA (Trypticase Soy Agar) dan diinkubasi selama 1-2 jam. Akan tetapi
penuhbuhan mikroorganisme perairan pada media agar hanya dapat menumbuhkan 10%
dari total mikroorganisme pada sampel tersebut.
Pengujian FDA dilakukan dengan menggunakan tabung falcon yang telah terisi
membran filter. Buffer fosfat kemudian ditambahkan sebanyak 20 mL kedalam tabung lalu
divorteks. FDA ditambahkan sebanyak 0.1 mL kedalam tabung dan homogenkan secara hatihati. Tabung falcon kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 30-60 menit dengan gojokan
200 rpm. Penambahan 20 mL 2:1 kloroform/methanol dengan cepat dan hati-hati setelah
dilakukan inkubasi. Tabung falcon kemudian dilakukan sentrifugasi (5000 x g selama 5
menit) yang bertujuan memisahkan buffer dan masa organik. Nilai absorbansi setiap tabung
diukur dengan menggambil 5 mL supernatant dan dilakukan pengukuran dengan
spektofotometer = 490 nm.
Penggunaan buffer membantu mikroorganisme tetap stabil pada larutan FDA.
Fluorescein diacetate (FDA) merupakan substrat esterase yang dapat digunakan dalam
pengujian kemampuan suatu mikroorganisme dalam melakukan aktivitas enzimatiknya. FDA
yang telah terhidrolisis akan menghasilkan fluorescein (Anonim, 1992). Penggunaan
kloroform dan methanol membantu dalam memisahkan biomassa mikroorganisme atau zat
organik lainnya sehingga fluorescein dapat terpisah seutuhnya (pemisahan dilakukan dengan
cara sentrifugasi (Anonim, 2004.).
Pembuatan kurva standar dilakukan untuk menentukan banyaknya FDA yang
terhidrolisis oleh aktivitas enzim pada suatu sampel. Pembuatan dilakukan dengan
menggunakan fluorescein kemudian dilakukan pengenceran dengan konsentrasi berbeda-beda
dan sesuai dengan standar. Larutan fluorescein dengan konsentrasi berbeda-beda dibuat pada
tabung kimax dan dilakukan perhitungan OD490 kemudian dibuat kurva. Persamaan akan
didapat dari terbentuknya kurva standar y = ax b (x = konsentrasi fluorescene y = OD yang
dihasilkan) (Grafik. 1). Jumlah fluorescein akan semakin tinggi seiring semakin besarnya
aktivitas enzim suatu sampel.
Hasil yang didapat sampel air sawah dapat menghasilkan fluorescein tertinggi
sebanyak -0.00657 g/mL, fluorescein yang dihasilkan air selokan dan air laut sebesar

-0.0067 g/mL dan -0.0068 g/mL (Tabel. 1). Hasil tersebut menujukan tidak terdapatnya
aktivitas enzim pada sampel yang digunakan karena hasil yang didapat < 0 (tidak terdapat
fluorescein yang dihasilkan). Sampel air tidak mengandung jasad mikroorganisme yang
memiliki enzim yang dapat memotong FDA (esterase, protease dan lipase). Hal tersebut dapat
disebabkan pada proses penumbuhan di media TSA tidak terjadi pertumbuhan hingga banyak
mikroorganisme yang mati dikarenakan agar memiliki gradien yang tinggi dan tidak sesuai
untuk mikroorganisme air. Kualitas alat spektofometer dalam membaca nilai OD (Obtical
Density) sangat menentukan hasil.
Pada pembentukan kurva standar didapat persamaan yang digunakan dalam
perhitungan jumlah fluorescein dan regresi sebesar 0.5362. Nilai regresi yang didapatkan
tidak mendekati 1 sehingga dapat disimpulkan dalam pembuatan larutan fluorescein standar
tidak terjadi saling terhubungan sehingga kurva standar yang dihasilkan kurang baik.
Sebaiknya pembuatan kurva standar dilakukan kembali hingga didapat nilai regresi
menedekati 1.

V.

Kesimpulan

a. Kesimpulan
Metode perhitungan aktivitas enzimatik dapat dilakukan dengan metode kolorimetri.
Salah satunya dengan menggunakan metode FDA (fluorescein diacetat) assay, dalam
pengujian tersebut digunakan FDA sebagai substrat yang akan dirombak oleh
mikroorganisme dengan enzimnya dan mengasilkan senyawa fluorescein (kuningkehijauwan). Perhitungan aktivitas enzim ditentukan oleh banyaknya fluorescein dihasilkan,
dengan cara membuat larutan fluorescein standar kemudian dibentuk kurva hingga
didapatkan persamaan. Persamaan yang telah didapat digunakan untuk menghitung
konsentrasi fluorescein dengan menggunakan nilai OD490 didapat.
Pengujian yang telah dilakukan diketahui konsentrasi fluorescein yang dihasilkan < 0
atau sama dengan 0. Hal tersebut menunjukan tidak terjadinya reaksi enzimatis yang
dilakukan mikroorganisme dalam memotong substrat FDA. Kesimpulan yang didapat saat ini
mikroorganisme pada sampel air yang digunakan tidak dapat memproduksi enzim protease,
lipase dan esterase.
b. Saran

Pengujian hidrolisis fluorescein diacetate (FDA) sangat dipengaruhi nilai OD490 yang
dihasilkan. Oleh karena itu kualitas peralatan (spektofotometer dan kuvet) selain itu
keterampilan dalam melaksanakan pengujian menjadi faktor penting. Pembuatan kurva
standar haruslah yang terbaik dengan nilai regresi mendekati 1 (ex: 0.9xx) sehingga
persamaan linear (y = ax b) yang terbentuk akan sangat baik dan dapat digunakan dalam
menentukan konsentrasi fluorescein yang dihasilkan. Persiapan sampel yang akan diuji tidak
seharusnya ditumbuhkan pada media agar mengingat sampel yang digunakan adalah air
sehingga dalam proses pertumbuhannya hanya mikroorganisme tertentu saja yang dapat
tumbuh.

Daftar Pustaka
Anfinsen, C. 1973 . Principles that govern the folding of protein chains. Science 181 (4096),
pp: 223230.
Anonim. 1992. Fluorescein Diacetate (FDA). <www.lifetechnologies.com>, diakses 15
Maret 2015.
Anonim. 2004. Fluorescein diacetate hydrolysis assay. Laboratory for Environmental
Pathogens Research, Department of Environmental Sciences, University of Toledo.
Anonim. 2002 . Introducing Microbes . <www.microbiologyonline.org.uk>, diakses 15 Maret
2015.

Black J G. 1999. Microbiology : Principles and Explorations. New Jersey : Prentince Hall.
Chandrasekaran, M. and Kumar. 2011. Marine Microbial Enzymes. Biotechnologi 9, pp: 115.
Ma, B. and R. Nussinov. 2010. Enzyme dynamics point to stepwise conformational selection
in catalysis. Current Opinion in Chemical Biology 14, pp: 652659.
Petsko GA, Ringe D. 2003. Chapter 1: From sequence to structure Protein structure and
function. New Science, London.
Schomburg, I., A. Chang, S. Placzek, C. Sohngen, M. Rother, M. Lang, C. Munaretto, S.
Ulas, M. Stelzer, A. Grote, M. Scheer and D. Schomburg. 2013. BRENDA in 2013:
integrated reactions, kinetic data, enzyme function data, improved disease
classification: new options and contents in BRENDA. Nucleic Acids Research 41, pp:
764-772.
Suzuki H. 2015. Chapter 7: Active Site Structure". How Enzymes Work: From Structure to
Function. CRC Press, pp: 117140.
Vasella A, Davies G, Bhm M. 2002. Glycosidase mechanisms. Current Opinion in Chemical
Biology 6 (5): 619629.