Laporan Praktikum Bioteknologi

“PCR DNA Bakteri Asam Laktat Menggunakan Primer LDH”

Disusun Oleh:
Nofita Sari (17304241012)
Kelompok 1
Pendidikan Biologi A 2017

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2020
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dewasa ini berkembang semakin
pesat. Salah satu perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi yang sering diterapkan
adalah bioteknologi. Bioteknologi merupakan pemanfaatan berbagai prinsip ilmiah dan
rekayasa terhadap organisme, sistem, atau proses biologis untuk menghasilkan atau
meningkatkan potensi organisme maupun menghasilkan produk dan jasa bagi
kepentingan hidup manusia.
Secara umum bioteknologi dikelompokkan menjadi dua, yaitu bioteknologi
tradisional dan bioteknologi modern. Bioteknologi tradisional merupakan bioteknologi
yang memanfaatkan mikroba, proses biokimia, dan proses genetik yang terjadi secara
alami. Produk dari bioteknologi tradisional tersebut antara lain: tempe, oncom, yoghurt,
dan keju. Bioteknologi tradisional ini terus mengalami perkembangan hingga
ditemukannya struktur DNA yang diikuti dengan penemuan lainnya.
Dengan ditemukannya struktur DNA dan berkembangnya ilmu pengetahuan
tentang DNA, munculah istilah bioteknologi modern. Bioteknologi modern merupakan
bioteknologi yang didasarkan pada manipulasi atau rekayasa DNA. Bioteknologi yang
didasarkan pada manipulasi DNA ini dilakukan dengan memodifikasi gen spesifik dan
memindahkannya pada organisme yang berbeda, seperti bakteri, hewan, dan tumbuhan.
Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu
metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini pertama kali
dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. Amplifikas DNA pada PCR dapat
dicapai bila menggunakan primer oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA
suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA.
PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA.
Umumnya primer yang digunakan pada PCR terdiri dari 20-30 nukleotida. DNA template
(cetakan) yaitu fragmen DNA yang akan dilipat gandakan dan berasal dari patogen yang
terdapat dalam spesimen klinik. Enzim DNA polimerase merupakan enzim termostabil
Taq dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
 menempel pada ujung 3‟ primer ketika proses pemanjangan dan ion magnesium
menstimulasi aktivasi polimerase.

B. Tujuan

Tujuan : Mengetahui Teknik PCR DNA Bakteri Asam Laktat Menggunakan Primer LDH.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida
tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun
1985. Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan
bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n kali
banyaknya DNA target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam
jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5µg,
oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam
volume 50-100 µl. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu
sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipat gandakan suatu sekuens DNA dalam
genom bakteri (Hasibuan, 2015).

PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro yang melibatkan
beberapa tahap yang berulang (siklus) serta terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda
pada setiap siklusnya (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Prinsip dari teknik PCR adalah
memperbanyak bagian spesifik dengan enzim DNA polimerase yang diinisiasi oleh pelekatan
primer dengan menghubungkan deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) dalam reaksi termal
(Raven dan Johson, 2002). Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah
template DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs
(Deoxynucleotide trifosfat); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase
DNA (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Menurut Diss (2003), primer mempengaruhi spesifitas
dan sensitivitas reaksi PCR. Rancangan suatu primer merupakan salah satu parameter penentu
keberhasilan suatu proses PCR. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang
akan diamplifikasi sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan
untuk proses eksistensi DNA (Handoyo dan Rudiretna, 2001).
Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah (Yusuf, 2010) :

a. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA cetakan yang
digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106 molekul. Dua hal penting tentang cetakan
adalah kemurnian dan kuantitas.

b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 – 28 basa

nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Dan mempunyai
kandungan G + C sebesar 50 – 60%.

c. Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP. dNTP
mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang
diperlukan untuk reaksi polimerasi.

d. Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai
DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini
diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim polimerase taq tahan terhadap
pemanasan berulang-ulang yang akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak
tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder.

e. Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Larutan buffer PCR umumnya
mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o C); 50 mM KCl; 0,1% gelatin
atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak 0,01% atau dapat diganti
dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%; disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.
Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin yang
memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan
mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi.

Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30 - 40
siklus dan berlangsung dengan cepat (Yusuf, 2010) :

1. Denaturasi
Denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke
dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA
untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3
 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA
untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami
renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini
mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu
lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim
tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-
masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5 0C.
2. Annealing (penempelan primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik adalah
bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 %
G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam
masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen,
karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada
primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa
digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer,
semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang
digunakan adalah antara 36 0C sampai dengan 72 0C, namun suhu yang biasa
dilakukan itu adalah antara 50 – 60 0C.
3. Pemanjangan Primer (Extention)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA
primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut
pada suhu 720C diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada
buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target. Dengan demikian
untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah
lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus
PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit
sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.
 BAB III

METODE

A. Alat dan Bahan

Alat :

- Mikropipet
- Tube
- Tip pipet
- Microsentrifuge
- Mesin PCR
- Rak tube
- Botol jam

Bahan :

- PCR Mix
- NFW
- DNA template
- Sampel : B21
- Primer (forward (F1), reverse (R2)) : LDH

B. Cara Kerja
Alat dan bahan disiapkan kemudian PCR Mix, NFW, DNA template, serta primer
diambil untuk 1 kelas terlebih dahulu. Volume bahan yang diambil menyesuaikan dengan
jumlah kelompok yang ada dalam kelas, yaitu sebanyak 4 kelompok. Bahan diambil
menggunakan mikropipet dan tip pipet, kemudian dimasukkan ke dalam tube. Dari
keempat kelompok yang ada, masing – masing mendapat tube serta sampel yang berbeda
– beda. Berikut sampel yang didapat oleh setiap kelompok : Kelompok 1 : B21,
Kelompok 2 : B26, Kelompok 3 : J15, Kelompok 4 : J28. Sampel dimasukkan ke dalam
tube paling akhir setelah PCR Mix, NFW, DNA template, dan primer diambil. Khusus
sampel diletakkan pada dinding tabung tube. Tube lalu diberi label nama kelompok.
 Setelah semua bahan dimasukkan ke dalam tube dan tube diberi label, tube
kemudian diletakkan ke dalam microsentrifuge selama kurang lebih 5 detik agar semua
bahan homogen. Tube kemudian dimasukkan kedalam mesin PCR. Waktu dan suhunya
diatur untuk tiap tahapnya. Predenaturasi 3 menit, denaturasi 30 detik 94 0C annealing 54
0
C 1 menit, elongasi 2 menit 72 0C, final extends 5 menit 72 0C. Temperatur simpanan /
storage temperature 4 0C waktunya tak hingga.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Primer : LDH

Forward (F1) : GCTGCCAAGCGAGAGAAATGCG

Reverse (R2) : GTCTGTCAATTTTGTTTCGGCGA

B. Pembahasan
PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro yang
melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) serta terjadi duplikasi jumlah target
DNA untai ganda pada setiap siklusnya (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Prinsip dari
teknik PCR adalah memperbanyak bagian spesifik dengan enzim DNA polimerase yang
diinisiasi oleh pelekatan primer dengan menghubungkan deoksiribonukleotida trifosfat
(dNTP) dalam reaksi termal (Raven dan Johson,2002).
Proses PCR yang dilakukan yaitu Predenaturasi 3 menit, denaturasi 30 detik 94 0C
annealing 54 0C 1 menit, elongasi 2 menit 72 0C, final extends 5 menit 72 0C. Temperatur
simpanan / storage temperature 4 0C waktunya tak hingga.

Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut (Hasibuan,
2015) :

1).Denaturasi.

Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas
tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan primer dan
tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada suhu 90-95°C selama
beberapa menit. Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua
untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan
putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen.Pada tahap ini, seluruh
reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.
Suhu sesuai teori denaturasi 94 0C namun dengan waktu 30 detik yang tidak sampai 1
menit.

2).Penempelan Primer.

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang
spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing ini, ikatan
hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat. Proses
ini biasanya dilakukan pada suhu 50 – 60 °C. Selanjutnya, DNA polymerase akan
berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan
putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya misalnya pada 72 °C.
Suhu annealing sesuai teori annealing 54 0C (antara 50 – 60 °C ) dengan waktu 1 menit.
Suhunya 540C karena TM - 50C.

3). Reaksi Polimerisasi (Extension)

Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72
°C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3‟nya
dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika
siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan di
amplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga
mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah
siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA
sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus
akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga
perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. Suhu elongasi sesuai teori yaitu 72
0
C dengan waktu 2 menit.

PCR dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap
siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3‟ dari potongan
DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan
menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung ujung 5‟-nya. Proses
PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut thermocycler.
 Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh
tahapan berikut:

a). Pradenaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan

denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif
kalau dipanaskan terlebih dahulu).

b). Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72 °C) selama 5-15 menit
untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang
secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir. Final elongasi
selama 5 menit sesuai teori.

Primer : LDH

Forward (F1) : GCTGCCAAGCGAGAGAAATGCG

Reverse (R2) : GTCTGTCAATTTTGTTTCGGCGA

Secara umum, primer yang ideal memiliki panjang antara 18 sampai 30 oligonukleotida.
Panjang ini diharapkan cukup untuk dapat mengikat template pada suhu annealing dan
mendapatkan sekuen yang spesifik (Borah, 2011). Jika primer terlalu pendek maka dapat
mengurangi spesifisitas primer sehingga mudah menempel pada template dengan suhu annealing
yang tidak diinginkan. Sedangkan jika primer terlalu panjang tidak mempengaruhi spesifisitas
secara bermakna (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Primer yang baik merupakan primer yang
memenuhi kriteria parameter primer. Parameter tersebut antara lain: Panjang primer, melting
temperature, (Tm), pair tm mismatch, anneling temperature (Ta), GC clamp, persentase jumlah
G dan C (%GC), self dimer, cross dimmer, runs, repeats, dan hairpins. Melting temperature (Tm)
untuk primer forward dan reverse primer ummnya berkisar antara 42-65 oC. Primer dengan Tm
berkisar antara 52-58oC sangat ideal, sedangkan Tm di atas 65oC akan mengurangi efektifitas
anneling sehingga proses amplifikasi DNA kurang berjalan baik (Popp, Prof. Dr. J. and Prof. Dr.
M. Bauer, 2015).
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan
Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi
DNA secara in vitro. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA
dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Tahapan PCR yaitu mulai dari
Predenaturasi, Denaturasi, Annealing, Elongasi, serta Final Elongasi.
B. Saran
Saat praktikum sebaiknya berhati – hati dan dilakukan dengan memperhatikan
urutannya.
 DAFTAR PUSTAKA

Borah, P. 2011. Primer Designing for PCR. Science Vision. Vol. 11 (3): P. 134 -136.

Diss, T. 2003. The Polymerase Chain Reaction. In Crocker, J. dan Paul, G.M. editors. Molecular
Biology in Cellular Pathology. United Kingdom: John Willey and Sons, Ltd. P. 193-210.

Handoyo, D., dan A. Rudiretna. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polimerase
ChainReaction (PCR). Unitas. Vol. 9. No. 1. Halaman: 17-29.

Hasibuan E. 2015. Peranan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Terhadap Perkembangan Ilmu
Pengetahuan. Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.

Popp, J. and M. Bauer. 2015. Modern Techniques for Pathogen Detection. Pp. 60-62.

Raven, P. H., Johnson, G.B. 2002. Biology 6th Edition. New York : McGraw-Hill Company.

Yusuf, K. Z. 2010. Polimerase Chain Reaction (PCR). Saintek vol 5, N0 6.

 LAMPIRAN

Foto Keterangan Foto Keterangan

Memasukkan Memasukkan
bahan ke dalam tube ke dalam
tube mesin PCR

Microsentrifuge Mikropipet
untuk untuk
menghomogenkan mengambil
bahan PCR bahan dan
memindahkan
bahan ke tube

Tip pipet Botol jam untuk

wadah tip pipet