LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI-PARASITOLOGI

ENUMERASI MIKROORGANISME

Imelda Reza Adzania (17020201098)

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

STIKES RUMAH SAKIT ANWAR MEDIKA
SIDOARJO
2018
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Organisme mikroskopis adalah organisme yang hanya bisa dilihat dengan
menggunakan mikroskop. Salah satunya adalah bakteri yang merupakan organisme
mikroskopis. Keadaan bakteri di alam ini ada yang bersifat menguntungkan dan ada
yang bersifat merugikan bagi kepentingan manusia. Bakteri yang menguntungkan
dan merugikan bagi kepentingan organisme akuatik perlu dipelajari supaya bakteri
yang menguntungkan, keberadaannya (kapasitas jumlahnya) dapat diperbanyak
sedangkan untuk bakteri yang merugikan (patogen) jumlah populasinya dapat
ditekan dan dapat dilakukan tindakan pencegahan atau antisipasi infeksi bakteri
tersebut (Umam, 2008).
Jumlah koloni mikroba dapat diperkirakan dengan suatu metode perhitungan.
Terdapat dua metode perhitungan bakteri atau mikroba yaitu dengan metode hitung
secara langsung (direct methode) dan metode perhitungan secara tidak langsung
(indirect methode) dengan hitungan cawan baik dengan metode penyebaran
maupun metode penuangan. Suatu sampel diperkirakan mengandung lebih dari 300
sel mikroba per ml, per gram, atau per cm permukaan. Diperlukan pengenceran
sebelum ditumbuhkan pada media agar di dalam cawan petri, sehingga setelah
inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang tepat
dihitung dimana jumlah terbaik adalah 30-300 koloni. Beberapa koloni yang
bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana
jumlah koloni dapat dihitung sebagai satu koloni dan satu rantai koloni (Pelczar,
2008).
Dalam praktikum kali ini menggunakan Haemacytometer dan TPC (Total
Plate Count), serta spektrofotometer ( turbidimeter ) untuk menghitung jumlah
bakteri dan koloni yang ada. Kedua metode ini sering sekali digunakan karena
kedua metode ini terhadang menghasilkan hasil perhitungan yang mirip namun
keduanya mempunyai prinsip yang berbeda. Haemacytometer dan TPC (Total Plate
Count) merupakan metode menghitung bakteri secara langsung, sedangkan
menggunakan spektofotometer merupakan metode menghitung bakteri secara tidak
langsung.
1.2 RUMUSAN MASALAH
Rumusan masalah dari laporan ini adalah :
1. Bagaimana cara menentukan jumlah bakteri tertentu secara langsung
dengan menggunakan Haemacytometer dan TPC (Total Plate Count) ?
2. Bagaimana cara mampu menentukan jumlah bakteri secara tidak langsung
dengan spektofotometer ?
1.3 TUJUAN
Tujuan dari laporan ini adalah :
1. Mahasiswa mampu menentukan jumlah bakteri tertentu secara langsung
dengan Haemacytometer dan TPC (Total Plate Count).
2. Mahasiswa mampu menentukan jumlah bakteri secara tidak langsung
dengan spektrofotometer.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 PERHITUNGAN BAKTERI
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji
kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji
kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu
sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji
kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode
cawan petri (metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada
anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni
yang merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang
terdapat pada sampel) seperti yang dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991).
Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung
jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada dua cara
penghitungan bakteri, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara
perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari
suatu bahan (preparat sedrhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang
hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan secara tidak langsung hanya
mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count).
Dalam pelaksanaannya ada beberapa cara yaitu perhitungan pada cawan petri (total plate
count / TPC, perhitungan melalui pegenceran, perhitungan jumlah terkecil atau
terdekat (MPN methode), calorimeter /cara kekeruhan atau turbidimetri (Anonim,
2013).
Mikrobiologi seperti kita ketahui dapat diperkirakan jumlahnya dengan suatu
metode perhitungan, yaitu perhitungan langsung (indect count) Jumlah sel atau
biomassa mikroba. Sel dihitung langsung di bawah mikroskop atau dengan
perhitungan partikel elektronik (electronic particle counter). Pengukuran langsung
mikroba seperti massa sel ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat
seluruh sel biomassa dapat dikoreksikan dengan jumlah sel dengan
membandingkannya pada kurva standar. Penghitungan tidak langsung jumlah sel
mikroorganisme dalam sampel di konsentrasikan dan ditanam pada media yang
sesuai. Pertmbuhan mikroorganisme seperti pembentukan koloni dalam medium
agar digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di
dalam sampel (Anonim, 2013).
2.2 METODE LANGSUNG
Menurut Jimmo (2013), menyatakan bahwa prinsip dari perhitungan metode
hitungan cawan adalah bila sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada
medium, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni
yang dapat dilihat langsung dan kemudian dapat dihitung tanpa menggunakan
mikroskop. Metode hitungan cawan dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang
(pour plate) dan metode permukaan (surfacelspread plate). Pada metode tuang,
sejumlah sampel (1 ml atau 0,1 ml) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan
ke dalam cawan petri, kemudian ditambhkan agar-agar cair yang steril yang telah
didinginkan (47-50oC) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya
menyebar. Metode ini merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan
jumlah jasad renik, dengan alasan :
1. Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung
2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampakan spesifik.
Selain keuntungan-keuntungan tersebut di atas, metode hitungan cawan juga
memiliki kelemahan sebagai berikut :
1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan hasil yang sebenarnya, karena beberapa
sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni.
2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang
berbeda pula.
3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang kompak, jelas, dan tidak mnyebar.
4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan
Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang
hidup dapat berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada
cawan adalah indeks bagi jumlah mikroorganisme yang terkandung dalam sampel.
Teknik yang harus dikuasai dari metode ini adalah mengencerkan sampel dan
mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi, jumlah semua koloni
diamati untuk memenuhi persyaratan statistik. Cawan yang dipilih untuk
menghitung koloni adalah cawan yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni.
Organisme yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah
koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan
(Lud, 2007).
2.3 METODE TIDAK LANGSUNG
Perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam
pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate
count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau
terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri)
(Sutedjo, 1991).
Menurut Hadietomo (1990) menyatakan bahwa perhitungan secara tidak
langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu:
1. Penentuan volume total
Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuran
volume total butir-butir darah, misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi khusus (tabung hopklins) yang bagian bawahnya berupa silinder dan bergaris
ukuran.
2. Metode turbidometri
Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur keker han suspensi atas dasar
penyerapan dan pemencaran cahaya yang dilintaskan, sehingga yang mengandung
lebih dari 107-108 sel/ml, tampak lebih keruh oleh mata telanjang. Suatu volume
biakan yang telah ditakar ditempatkan dalam tabung khusus yang jernih dengan
diameter tertentu. Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah
bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap
cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah).
Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam
biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut
optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm –
700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah
organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran optical
density/ditentukan dengan spektrofotometer (Anonim, 2013).
 BAB III
METODOLOGI

3.1 ALAT DAN BAHAN

3.1.1 ALAT
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah : Haemacytometer,
TPC, spektrofotometer, cawan petri, bunsen burner, tabung reaksi, kuvet, pipet tetes
steril, inkubator, dan rotary shaker.
3.1.2 BAHAN
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah : agar nutrisi (NA), Nutrient
Broth (NB), aquades steril, dan bakteri yang berumur 24 jam.
3.2 CARA KERJA
3.2.1 Perhitungan sel dengan haemacytometer
1. Siapkan counting chamber Haemacytometer Improved Neubauer.
2. Gunakan pipet dan teteskan 1 tetes sampel pada daerah berkotak di
Haemacytometer.
3. Hitung jumlah sel dalam kotak-kotak yang ditentukan, kemudian hasilnya
kalikan dengan faktor pengenceran bila diencerkan.
3.2.2 Perhitungan sel dengan TPC (Total Plate Count)
1. Ambil air sampel dengan menggunakan pipet tetes.
2. Tandai tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades steril dengan tulisan angka
10-2 dan 10-4, sedangkan cawan petri dengan angka 10-1, 10-3, dan 10-5.
3. Ambil air sampel dengan menggunakan pipet dan tuangkan masing-
masing 1 ml pada tabung 10-2 dan tuangkan 1ml pada tabung reaksi 10-4
serta 0,1 ml pada cawan petri 10-5.
4. Kocok tabung reaksi 10-2 sampai merata, pipet suspensi dari tabung reaksi
10-2 dan tuangkan 1 ml pada tabung reaksi 10-4 serta 0,1 ml pada cawan
petri 10-3.
5. Kocok tabung reaksi 10-4 sampai merata, pipet suspensi dari tabung reaksi
10-4 dan tuangkan 1 ml pada tabung reaksi 10-6 serta 0,1 ml pada cawan
petri 10-5.
 6. Tuangkan agar NA yang masih mencair (suhu 45ºC) pada masing-masing
cawan petri yang sudah berisi sampel dan campurkan dengan cara
menggoyang-goyangkannya.
7. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam.
8. Hitung koloni yang tumbuh dan jumlah sel.
3.2.3 Perhitungan sel dengan turbiditas (kekeruhan) menggunakan
spektrofotometer
1. Siapka enam buah kuvet dan beri label : 0-5
2. Masukkan 0,5 ml aquades steril ke dalam tabung reaksi berlabel 1-5
menggunakan mikropipet.
3. Masukan 1 ml kultur bakteri ke dalam tabung reaksi berlabel 0.
4. Buat pengenceran bertingkat dengan memasukkan 0,5 kultur baakteri dari
kuvet berlabel 0 ke dalam kuvet berlabel 1 tambhakan 0,5 aquades steril
kemudian kocok menggunakan mikrotip.
5. Lakukan dengan cara yang sama sampai pada kuvet berlabel 5 dan
gunakan tip yang baru setiap pengambilan kultur bakteri dari label yang
berbeda.
6. Bacalah absorbansi masing-masing kuet dengan memasukkannya dalam
tempat spektofotometer dengan panjang gelombang 600nm
7. Buat kurva standar
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 HASIL PENGAMATAN
METODE GAMBAR KETERANGAN
Haemacytometer Perbesaran: 40 ×
Jumlah Sel:
= 46 × 2500 × 106
16
= 2,88 × 2500 × 106
= 7200 × 106
= 72 × 108
= 7,2 × 109 sel/ml
Total Plate Count Cawan Petri: 10-6
(TPC) Jumlah Koloni: 44
TPC:
= Jumlah Koloni × Faktor Pengenceran

= 44 × 10-6
= 44 × 106 cfu/ml
= 4,4 × 107

Spektrofotometer Absorbansi: 0,002 (10-6)

1,833
×
0,355

0,014

0,002

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

4.1 PEMBAHASAN
4.2.1 ANALISA PROSEDUR
Penghitungan sel dengan haemacytometer: Teteskan satu tetes sampel
pada daerah berkotak haemacytometer dengan pipet tetes (panaskan setiap
alat yang akan digunakan pada api bunsen), hitung jumlah sel dalam kotak-
kotak yang ditentukan dibawah mikroskop cahaya, dengan hand tally
counter. Hasil kalikan dengan faktor pengenceran.
Penghitungan sel dengan total plate count (tpc): Letakkan cawan petri
yang berisi sel bakteri yang telah diikubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam
pada total plate count (tpc), hitung setiap sel pada cawan petri.
Penghitungan sel dengan turbiditas (kekeruhan) menggunakan
spektrofotometer: masukkan 1ml kultur bakteri dalam tabung reaksi berlabel
0 kedalam kuvet berlabel 1 dan tambahkan 0,5ml aquadest steril, kocok /
homogenkan dengan menggunakan mikrotip. Lakukan dengan cara yang
sama sampai pada kuvet berlabel 5 (gunakan tip yang baru pada setiap
pengambilan kultur bakteri dari label yang berbeda-beda). Masukkan dalam
spektofotometer dengan panjang gelombang 600nm dan bacalah absorbansi
masing-masing kuvet.

4.2.2 ANALISA HASIL

Hasil dari penghitungan sel dengan haemacytometer yang terlihat pada
kotak-kotak coloni counter yang telah diamati dibawah mikrokop cahaya
dengan perbesaran 40× dengan hand tally counter, sel bakteri berjumlah
= 46 × 2500 × 106
16
= 2,88 × 2500 × 106
= 7200 × 106
= 72 × 108
= 7,2 × 109 sel/ml
 Penghitungan sel dengan total plate count (tpc), pada tpc berjumlah 44 sel
bakteri dalam cawan petri 10-6,
= Jumlah Koloni × Faktor Pengenceran
= 44 × 10-6
= 44 × 106 cfu/ml
= 4,4 × 107.
Dan penghitungan sel dengan turbiditas (kekeruhan) menggunakan
spektrofotometer, pada spektofotometer absorbansi:
(10-1= 0,014) (10-2= 0,002) (10-3= -) (10-4= 0,355) (10-5= 1,833) (10-6= 0,002)
 BAB V
PENUTUP
5.1 KESIMPULAN
!Jumlah bakteri secara langsung dapat ditentukan dengan haemacytometer dan total
plate count (tpc)
Dan secara tidak langsung dengan spektofotometer
 .DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2013.”Perhitungan Jumlah Bakteri”.

httpwww.scribd.comdoc135885742/perhitungan-jumlah-bakteri=htm.
Hadietomo, Ratna. 1990.Mikrobiologi Dalam Praktek. Jakarta : PT. Gramedia.

Jimmo.2013.”Perhitungan Pertumbuhan Mikroba”.http://pertumbuhan mikroba-

jimmo.blogspot.com.

Waluyo, Lud. 2007.Mikrobiologi Umum. Makassar : UMM Press.

Pelczar,Michael J. ECS. Chan. 2008. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Penn, C. 1991. Handling laboratory microorganism. Open university: Milton
Keynes.
Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi tanah. Jakarta:Renika cipta.
Umam, AH. 2008. Perhitungan jumlah bakteri pada suatu bahan. [terhubung
berkala]http://www.scribd.com/doc/15564954/8317266pertumbuhanbakteri
diakses pada 30 Maret 2018.