LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI DASAR

ISOLASI, ENUMERASI DAN PURIFIKASI

Disusun Oleh:

Trias Jaya Susanti (14030204054)

Nurul afidah Hanis (14030204081)

Khafidz ardiansyah (14030204088)

Elly Ohana (14030204089)

Desy Muwaffaqoh (14030204094)

Pendidikan Biologi B 2014

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA

2016
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam kebutuhan di berbagai bidang, kita membutuhkan mikroba untuk

dikembangbiakkan di dalam suatu medium. Penanaman dan pertumbuhan
mikroba tersebut dinamakan pembiakan mikroba. Pemeliharaan mikroba
dilakukan secara in- vitro. Penanaman ini dilakukan dengan tujuan untuk
memperbanyak pertumbuhan mikroba tersebut. Proses ini tentu tidak lepas
begitu saja dari kebutuhan hidup mikroba, sehingga penanaman membutuhkan
penyediaan nutrien yang terdiri dari campuran bahan-bahan hara yang sangat
berguna untuk perkembangan mikroba dan menunjang kehidupan mikroba
yang dibiakkan. Penyediaan bahan-bahan makanan ini disebut juga sebagai
medium pertumbuhan. Dengan menggunakan macam-macam medium dapat
dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan penentuan
jumlah mikroba (Suriawiria, 2005).
Di dalam bidang ilmu mikrobiologi ada suatu hal mendasar yang juga
perlu diperhatikan yaitu analisia kualitatif terhadap suatu bahan. Suatu analisis
ini Sangat penting untuk mengetahui jumlah mikroorganisme yang ada pada
suatu sampel tertentu mengandung banyak mikroorganisme atau sebaliknya.
Analisis kualitatif atau biasa disebut dengan enumerasi mikroorganisme dalam
hal ini dapat dilakukan baik dengan perhitungan langsung terhadap suatu
sampel yaitu salah satunya dengan alat bantu mikroskop, maupun dengan cara
tidak langsung yaitu dengan beberapa metode perhitungan. Dalam percobaan
ini akan dibahas secara lebih lanjut mengenai bagaimana cara perhitungan
jumlah sel yang ada di dalam suatu medium yang mana umumnya digunakan
untuk uji mikrobiologi bahan pangan yaitu metode perhitungan secara
langsung, dan dapat kita terapkan pada sampel pengujian salinitaasi lingkungan
sehingga dengan demikian diharapkan kita akan lebih memahami tentang
bagaimana prosedur perhitungan yang baik.
1.2 Rumusan Masalah

1. Manakah sampel yang menghasilkan jumlah bakteri tertinggi dan

terendah?
2. Apakah yang menyebabkan perbedaan jumlah bakteri pada beberapa
sampel?
3. Bagaimana seharusnya nutrisi untuk isolasi bakteri tanah?
4. Bagaimana keanekaragaman dan karakteristik morfologi koloni pada hasil
pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7?
5. Bagaimana hasil pemurnian koloni bakteri menggunakan metode streak
cawan petri dan tabung reaksi?
6. Bagaimana peran bakteri bagi tanah dan tanaman?

1.3 Tujuan

1. Untuk mengetahui sampel yang menghasilkan jumlah bakteri tertinggi dan

terendah.
2. Untuk mengetahui penyebab perbedaan jumlah bakteri pada beberapa
sampel.
3. Untuk mengetahui nutrisi seharusnya yang digunakan untuk isolasi bakteri
rizosfer.
4. Untuk mengetahui keanekaragaman dan karakteristik morfologi koloni
pada hasil pengenceran 10-5, 10-6 dan 10-7?
5. Untuk mengetahui hasil pemurnian koloni bakteri menggunakan metode
streak cawan petri dan tabung reaksi.
6. Untuk mengetahui peran bakteri bagi tanah dan tumbuhan.

1.4 Manfaat

Mengetahui teknik dan prosedur isolasi, enumerasi dan purifikasi untuk

selanjutnya hasil dari praktikum akan digunakan untuk praktikum lebih
lanjut.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

1. Tanah

Secara ekologis, tanah tersusun dari tiga kelompok material, yaitu

material biotik, abiontik (bahan organik) dan abiotik (pasir, debu, liat).
Umumnya sekitar 5% penyusun tanah merupakan biomass (biotik dan
abiontik) yang memiliki peran sangat penting. Material biotik tanah
dikelompokkan menjadi 2 yaitu fauna dan mikroflora. Fauna meliputi hewan
invertebrata dan mikroflora mencakup ganggang, cendawan, aktinomisetes
dan bakteri. Populasi, jenis dan aktivitas mikrobia dalam tanah tergantung
pada kondisi tanah. Pada lahan pertanian, kegiatan pertanian yang dilakukan
akan menentukan populasi, jenis dan aktivitas mikrobianya. Satu gram tanah
subur dapat mengandung >1000 juta sel bakteri yang masing-masing
berdiameter 1 m dan panjang beberapa m, dengan total biomass (bahan
organik > 2 ton/ha (Hanafiah dkk; 2005).

Tanah merupakan suatu ekosistem yang mengandung berbagai jenis

mikrobia dengan morfologi dan sifat fisiologi yang berbeda-beda. Dalam
ekosistem tanah pula, berbagai mikrobia hidup, bertahan hidup dan
berkompetisi dalam memperoleh ruang, oksigen, air, hara dan kebutuhan
hidup lainnya baik secara simbiotik maupun non-simbiotik sehingga
menimbulkan berbagai bentuk interaksi. Interaksi mikrobia dapat terjadi
bukan hanya pada tanah namun bisa juga dengan tanah dekat perakaran
tanaman atau disebut rizosfer.

2. Rizosfer

Daerah rizosfer merupakan lapisan tipis yang tetap menempel pada akar
setelah menggoyangkan perakaran. Populasi mikroorganisme di rizosfer
umumnya lebih banyak dan beragam dibandingkan pada tanah nonrizosfer.
Aktivitas mikroorganisme rizosfer dipengaruhi oleh eksudat yang dihasilkan
oleh perakaran tanaman. Faktor yang menyebabkan lebih banyak
 mikroorganisme yang ditemukan pada tanah rizosfer berhubungan dengan
tipe tanah, kelembaban, pH, temperatur, umur dan kondisi tanaman. Rizosfer
bisa merupakan bagian dari tanah yang secara langsung dipengaruhi oleh
substansi yang dikeluarkan oleh perakaran tanaman sehingga tercipta kondisi
menyenangkan bagi bakteri untuk memanfaatkannya. Beberapa
mikroorganisme rizosfer berperan dalam siklus hara dan proses pembentukan
tanah, pertumbuhan tanaman dan pengendali hayati terhadap patogen akar
(Prayudyaningsih dkk; 2015).

Seperti dijelaskan sebelumnya bahwa mikrobia bisa berkompetisi

memperoleh unsur hara khusunya dengan akar tanaman. Karena penyerapan
unsur hara merupakan proses metabolisme yang aktif, kelebihan ATP yang
dihasilkan per satuan bobot jaringan per waktu tertentu merupakan cerminan
jumlah energi yang tersedia untuk penyerapan ion-ion hara. Misalnya bakteri
denitrifikasi yang memanfaatkan nitrat sebagai elektron akseptor pengganti
oksigen yang dibutuhkan dalam respirasinya sehingga mikrobia ini tidak
hanya mengambil nitrat dari ekosistem akar, tetapi juga bersaing dalam
memperoleh hara lain.

3. Isolasi dan Purifikasi

Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme tertentu

dari lingkungannya, sehingga diperoleh biakan yang tidak tercampur dengan
jenis yang lain. Biakan yang sudah tidak tercampur dengan jenis lain tersebut
disebut sebagai biakan murni. Prinsip dari isolasi mikrobia adalah memisahkan
satu jenis mikroba dengan mikroba yang lain yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya
dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap
pada tempatnya. Beberapa metode untuk mengisolasi bakteri sebagai berikut:

a. Metode Swab (ulas)

Metode ini dilakukkan jika kita akan mengisolasi mikroorganisme dari
sempel yang memiliki permukaan luas dan sulit dipindahkkan. Metode ini
menggunakan cotton bud steril yang telah dicelupkan ke larutan atraktan
terlebih dahulu.
 b. Metode Rinse (bilas)
Metode ini dilakukkan untuk melarutkan sel-sel mikroorganisme yang
menempel pada permukaan sempel yang luas tapi relative berukuran kecil.
Pada metode ini sampel dicelupkan ke dalam aquades steril dngan
perbandingan 1 : 9 (w/v).
c. Metode maseration (penghancuran)
Metode ini dilakukkan jika sampel yang digunakan berbentuk padat.
Sampel ditumbuk dalam mortar menggunakan pestle steril sehingga
mikroorganisme yang terdapat dipermukaan maupun di dalam dapat
terlepas dan larut dalam akuades steril. Perbandingan anrata berat sampel
dengan volume akuades steril yang ditambahkan setelah proses maserasi
adalah 1 : 9 (w/v).
3. Teknik Biakan Murni
Di alam bebas tidak ada mikroba yang sendiri terlepas dari spesies yang
lain. Seringkali bakteri patogen hidup bersama dengan mikroba sakroba
(saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana
memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta
mencegah pencemaran dari luar. Medium untuk membiakkan mikroba harus
steril sebelum digunakan. Pencemaran (kontaminasi) dari luar terutama
berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Tekni biakan
murni untuk suatu spesies ada beberapa cara, yaitu :
a. Cara Pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Beliau
berhasil membiakkan secara murni Strepcoccus lactis yang diisolasi dari
susu yang telah asam. Caranya yaitu dengan mengencerkan suatu
suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies kemudian
diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian
diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, kemudian dari pengenceran yang
kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lagi.
Langkah selanjutnya adalah dari pengenceran ketiga diatas, diambil
0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar
akan diperoleh beberapa koloni yang tumbuh pada medium tersebut,
tetapi mungkin juga hanya diperoleh satu koloni saja. Dalam hal seperti
ini, berarti telah diperoleh suatu biakan murni, dan selanjutnya spesies ini
dapat dijadiakn piaraan murni (biakan murni).
b. Cara Penuangan
Isolasi dengan menggunakan medium cair dengan cara
pengenceran, seperti yang dijelaskan di atas. Prinsip dalam melakukan
pengenceran adalah menurunkan jumlah mikroorganisme sehingga hanya
ditemukan suatu sel dalam satu tabung. Demikian juga dengan
penuangan.Caranya yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran
bakteri yang sudah diencerkan, kemudian disebarkan dalam suatu
medium dari kaldu dan gelatin encer. Setelah medium mengental, maka
selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni yang masing-masing
dapat dianggap murni.
c. Cara Penggesekan/Penggoresan
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang
terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri anaerob tidak dapat
tumbuh. Untuk mendapatkan koloni yang terpisah sewaktu melakukan
goresan, perlu memperhatikan hal-hal berikut ini:
Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores permukaan agar.
Sengkelit yang panas akan mematikan mikroorganisme, sehingga
tidak terjadi pertumbuhan pada bekas goresan.
Sewaktu menggores, ose dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.
Agar yang luka akan mengganggu pertumbuhan mikroorganisme,
sehingga sulit diperoleh koloni yang terpisah.
Ose harus dipijarkan setelah menggores, hal ini dengan tujuan
mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata ose dan
mencegah pencemaran pada penggoresan berikutnya.
Menggunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan supaya
terhindar dari pencemaran.
Membalikkan lempengan agar untuk mencegah air kondensasi jatuh di
atas pemukaan sehingga dapat terjadi penyebaran koloni.
Ada beberapa teknik penggesekan, yaitu:
a) Goresan T
Lempengan dibagi menjadi tiga bagian dengan huruf T pada
bagian luar dasar cawan petri.
Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan
sinambung.
Panaskan jarum ose dan dinginkan kembali.
 Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di
daerah II.
Pijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali.
Prosedur diatas diulangi untuk daerah III.
b) Goresan Kuadran, teknik ini sama dengan goresan T, hanya
lempengan agar dbagi menjadi 4.
c) Goresan Radian
Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.
Pijarkan ose dan dinginkan kembali.
Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus dimulai dari
bagian pinggir lempengan.
Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus di atas
goresan sebelumnya.
Pijarkan ose.
d) Goresan Sinambung
Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan
lempengan agar.
Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800, gunakan sisi mata ose
yang sama dan gores pada sisa pemukaan lempengan agar.
d. Cara Penyebaran (Agar Sebar)
Pengenceran sampel sama seperti pada cara-cara penuangan. Dengan
mengambil 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir
ke atas permukaan agar. Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang
terbuat dari gelkas. Pada teknik sterilisasi penyebar dilakukan dengan
mencelupkan ke dalam alkohol dan kemudian dipanaskan sehingga
alkohol terbakar habis. Penyebar didinginkan dahulu sebelum digunakan
untuk menyebarkan cairan sampel pada permukaan agar. Penyebaran
cairan contoh (sampel) dilakukan dengan memutar agar lempengan
tersebut.
4. Enumerasi
Enumerasi adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu
mediatanpa mengidentifikasi jenis mikroba, yang bertujuan untuk menentukan
jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif. Ada beberapa macam
cara untuk mengukur jumlah sel, antara lain:
Hitungan cawan
Teknik yang harus dikuasai dalam metode ini adalah mengencerkan
sample dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Untuk memenuhi
 persyaratan statistik, cawan yang dipilih untuk menghitung koloni adalah
yang mengandung antara 30 sampai dengan 300 koloni
Perhitungan Massa Sel (Metode Turbidimetrik)
Metode lainnya yang dapat digunakan untuk mikroba didalam satu larutan
adalah metode turbidimetri (kekeruhan) menggunakan spektrofotometer.
Menghitung berat kering sel
Pada metode ini, kultur mikroorganisme yang akan diukur disentrifuge
terlebih dahulu. Endapan yang terbentuk dikeringkan dan ditimbang.
Perhitungan sel mikroorganisme secara langsung dapat dilakukan dengan
menggunakan Haemocytometer. Keuntungan enumerasi secara langsung
adalah cara penghitungan yang cepat dan diperoleh informasi tambahan
tentang ukuran dan bentuk mikroba yang sedang dihitung dan jumlah sel
yang diperoleh meliputi sel yang hidup dan sel yang mati. Akan tetapi,
enumerasi secara langsung memiliki kelemahan yaitu sel yang hidup tidak
bisa dibedakan dengan sel yang mati. Koloni sel yang menggerombol
terkadang menyulitkan dalam mengklasifikasikan jenis koloni.

5. Nutrisi Pertumbuhan Bakteri

Nutrisi bagi pertumbuhan bakteri sama halnya dengan organisme yang

mempunyai kebutuhan akan sumber nutrisi, yaitu:

1. Bakteri membutuhkan sumber energi yang berasal dari cahaya ataupun

senyawa kimia.
2. Bakteri membutuhkan sumber karbon berupa karbon anorganik (CO2) dan
karbon organik (seperti karbohidrat).
3. Bakteri membutuhkan sumber nitrogen dalam bentuk anorganik maupun
organik.
4. Bakteri membutuhkan beberapa unsur logam.
5. Bakteri membutuhkan air untuk fungsi metabolik dan pertumbuhannya.

Bakteri dapat tumbuh pada medium yang mengandung satu atau lebih nutrisi
tersebut.

6. Pertumbuhan Bakteri
 Pertumbuhan bakteri dilihat berdasarkan populasi yang terbentuk.
Dikenal dengan istilah koloni bakteri. Pertumbuhan bakteri dapat dibedakan ke
dalam 4 fase utama yaitu fase lag (fase dimana bakteri diinokulasi dan masih
dalam tahap adaptasi dengan lingkungan baru, belum menunjukkan
perkembangan), fase eksponensial (fase pertumbuhan cepat karena adanya
nutrisi), fase stasioner (fase statis, jumlah bakteri hidup=jumlah bakteri mati)
dan fase decline (penurunan populasi, bakteri mati karena nutrisi habis).

Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Bakteri

1. Faktor nutrisi
Nutrisi bagi bakteri dalam bentuk karbon, faktor pertumbuhan, ion
anorganik dan oksigen. Dalam praktik mikrobiologi, glukosa secara luas
digunakan sebagai sumber karbon organik.
2. Faktor fisik
Berupa potensial reduksi-oksidasi, temperatur, pH, kondisi osmotik dan
aktivitas air. Setiap bakteri memiliki karakteristik sendiri untuk tumbuh
tergantung pada habitat asal (Kusnadi dkk; 2012).
7. Bakteri pada Tanah Rizosfer

Senyawa dari dalam tumbuhan bertanggungjawab untuk menyediakan

karbon tambahan yang memungkinkan rizosfer menjadi rumah bagi
mikroorganisme. Tanaman memiliki mekanisme untuk mengontrol produksi
dan pengendapan senyawa tersebut dalam rizosfer. Fungsi tersebut umumnya
dipengaruhi oleh kondisi lingkungan di sekitar akar. Selain itu, perbedaan
spesies juga berpengaruh terhadap kerja mekanisme tersebut. Senyawa yang
dihasilkan tanaman dikategorikan menjadi 5 yaitu eksudat, sekresi, lendir,
mucigel dan lisat (Backer dkk;2013).
Mikroorganisme tanah yang bermanfaat pada tanah rizosfer antara lain
bakteri pelarut fosfat (BPF) dan bakteri penambat nitrigen non-simbiotik.
Bakteri pelarut fosfat merupakan bakteri yang berperan dalam penyuburan
tanah karena mampu melarutkan fosfat dengan sekresi sejumlah asam organik
berbobot rendah seperti oksalat, suksinat, fumarat dan malat. Asam organik
akan berekasi dengan bahan oengikat fosfat membentuk khetal organik yang
dapat dimanfaatkan tanaman (Simanungkalit dan Suriadikarta; 2006).
Sedangkan bakteri penambat nitrogen non-simbiotik merupakan bakteri yang
mengubah nitrogen menjadi amonium tanpa bergantung pada organisme lain
(Danapriatna, 2010). Salah satu contoh bakteri pada tanaman umbi adalah
Micococcus dan Clostridium (Prayudyaningsih dkk; 2015).
 BAB III

METODE PENELITIAN

Isolasi bakteri

A. Alat dan Bahan

Tabung reaksi yang berisi aquades 7 buah
steril
Erlenmeyer yang berisi media padat 2 buah
Spuid 6 buah
Vortex 1 buah
Panci 2 buah
Kompor 1 buah
Cawan petri 6 buah
Timbangan 1 buah
Wrap 1 gulung

B. Langkah Kerja
Berikut adalah prosedur penanaman sampel mikroorganisme dari sampel uji:
1) Sampel uji ditimbang sebanyak 1 g (jika sampel uji yang digunakan
adalah sampel padat) atau ambil sampel uji sebanyak 1 ml (jika sampel
uji yang digunakan adalah sampel cair) dan memasukkannya kedalam
tabung reaksi yang berisi 9 ml akuades steril. Suspensi tersebut
merupakan pengenceran 10-1, setiap langkah dilakukan secara aseptis.
2) Mengambil 1 ml dari suspensi pengenceran 10 -1 (sebelum pengambilan
terlebih dahulu dilakukan homogenasi) dan memasukkannya kedalam
tabung reaksi 9 ml akuades steril. suspensi tersebut merupakan
pengenceran 10-2. Langkah tersebut diulang hingga mendapatkan
suspensi dengan faktor pengenceran 10-7.
3) Mengambil 1 ml dari pengenceran 10-5, 10-6, 10-7, dan memasukkannya
kedalam cawan petri steril secara terpisah dan dilakukan secara duplo.
4) Menuangkan media taoge agar yang telah dicairkan terlebih dahulu dan
suhu media kurang dari 45oC kesetiap cawan petri yang telah berisi
sampel.
5) Campuran sampel dengan media tersebut kemudian dihomogenkan. lalu
melakukan wrapping pada sisi tepi cawan.
6) Menginokulasi biakan tersebut dengan posisi terbalik, pada suhu antara
28-30oC selama 24-48 jam.
 7) Mengamati dan mencatat karakteristik koloni-koloni yang terbentuk.

Enumerasi jumlah mikroorganisme

A. Alat dan Bahan
Cawan yang berisi sampel
Colony counter 1 buah
Spidol 1 buah

B. Langkah Kerja
Berikut adalah prosedur enumerasi mikroorganisme dari sampel uji:
1) Mengamati koloni yang terbentuk pada setiap cawan setelah inkubasi.
2) Menghitung jumlah koloni yang terbentuk pada setiap cawan.
3) Menentukan jumlah mikroorganisme yang terdapat pada sampel uji
berdasarkan standart plate count.

Pemurnian mikroorganisme
A. Alat dan Bahan
spidol 1 buah
Jarum ose 1 buah
Cawan yang berisi media padat 1 buah
Inkubator 1 buah
Tabung reaksi yang terisi media agar 1 buah
miring

A. Langkah Kerja
1. Berikut adalah prosedur pemurnian sampel mikroorganisme dari sampel uji:
1) Menandai koloni yang akan dimurnikan.
2) Secara aseptis, koloni tersebut diambil dengan menggunakan jarum
ose kemudian digoreskan dengan metode cawan gores secara kuadran
pada media pada cawan peti baru.
3) cawan petri tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 oC
dengan posisi cawanpetri terbalik.
4) Mengamati hasil dari teknik cawan gores kuadran yang telah
dilakukan. Kemudian menentukan apakah terbentuk koloni tunggal
pada kuadran keempat. Koloni tunggal tersebut adalah koloni yang
telah murni dan dapat disebut sebagai biakan murni.
5) Koloni diambil dan ditanam pada media agar yang baru di tabung
reaksi (media agar miring).
6) Biakan tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 oC,
kemudian mengamati koloni yang tumbuh.
7) Jika koloni yang tumbuh sudah murni, maka koloni tersebut disimpan
dalam kulkas.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Praktikum

Berdasarkan hasil praktikum isolasi bakteri pada beberapa sampel tanah di

Universitas Negeri Surabaya Ketintang, didapatkan data berupa jumlah
bakteri per 1 gram sampel tanah yaitu sebagai berikut:

Tabel 4.1 Jumlah Bakteri dalam Sampel Tanah Menggunakan Metode SPC
SPC
Sampel Pengenceran Keterangan
Kel Cawan (CFU/ml)
tanah
10-5 10-6 10-7
1 Tanah A 133 46 27
47 x 106
rizhosfer 1,2 x 107 =3,8>2
B 114 48 24 12,3 x 10 6
Ficus
2 Tanah
A 150 81 27
7,1 x 10 7
rizosfer 1,3 x 107 7
=5,5>2
1,3 x 10
Angsana B 113 61 16
3 Tanah A 85 36 10 35,5 x 10 6
=4,7> 2
Masjid 7,6 x 106 7,6 x 106
B 66 35 7

4 Tanah 6
A 111 62 26 61 x 10
rhizosfer 9,55 x 10 6 6
=6,4> 2
9,55 x 10
ubi jalar B 80 60 28
5 Tanah 6
A 102 35 19 32,5 x 10
=3,5>2
rhizosfer 9,2 x 106 9,2 x 10 6
walisongo B 82 30 18
6 Tanah
A 55 41 4 35 x 106
rizosfer 4,3 x 106 =8,1>2
4,3 x 106
B 31 29 5
asoka
7 Tanah
A 128 10 2 128+18 5 6
rizosfer x 10 =7,3 x 10
7,3 x 106 2
lidah
B 18 4 1
buaya
8 Tanah A 110 84 7 6
48,5 x 10
rizosfer 1,7 x 107 6
=2,8>2
B 237 13 6 17,35 x 10
alamanda
 Berdasarkan data jumlah bakteri pada tabel tersebut, dapat diketahui
sampel yang memiliki jumlah bakteri tertinggi hingga terendah dalam grafik
(Gambar 4.1).

2 Gambar 4.1 Jumlah Bakteri

1.5 per 1 gram Sampel Tanah
1 Dihitung Menggunakan SPC
SPC (x 107 CFU/ml) Keterangan:
0.5 A: tanah rizosfer Ficus
0 B: tanah rizosfer Angsana
ABCDEFGH C: tanah Masjid
D: tanah rizosfer ubi jalar
Sampal tanah per 1 gram
E. tanah rizosfer walisongo
F. tanah rizosfer asoka
G. tanah lidah buaya
H. tanah rizosfer alamanda
Dalam praktikum ini, digunakan sampel dari tanah rizosfer Angsana
(Pterocarpus indicus Willd.). Satu gram sampel tanah rizosfer diencerkan
hingga 7 kali. Pengenceran dilakukan untuk mempermudah penghitungan
jumlah bakteri. Setiap pengenceran akan mengurangi konsentrasi bakteri
dengan jumlah tertentu sehingga dapat menentukan jumlah bakteri pada
sampel awal (Hartsock, 2016). Setelah pengenceran maka akan ditumbuhkan
pada media dengan teknik pour plate, teknik menuangkan bakteri dalam
cawan dan kemudian dituangkan media agar ke dalamnya. Hasil isolasi
bakteri dapat dilihat pada tabel 4.2 beserta dengan karakteristik morfologi
koloninya.
Tabel 4.2 Keanekaragaman Bakteri Rizosfer Angsana (Pterocarpus Indicus
Willd.) Beserta Karakteristik Morfologi Koloninya.
Sampe Jeni Pengencer Bentuk Margin Elevasi Optik Permuk Pigment Uk
l s an aan asi ura
kol n
oni
Tanah A I. 10-5, II. Irregul Undulat umbon Opaq Halus Pigment 0,3
-5 -
rizosfe 10 , I.10 ar e ate ue mengkil asi cm
6 -6
r , II.10 , ap (putih)
Angsa I.10-7,
na II.10-7
B I. 10-5, Circula Entire Flat Trans Halus Non
5
II.10- , r paran mengkil pigment
II.10-6 t ap asi
C I.10-5 Spinde Entire Flat Opaq Halus Pigment
Sampe Jeni Pengencer Bentuk Margin Elevasi Optik Permuk Pigment Uk
l s an aan asi ura
kol n
oni
l ue mengkil asi
ap (putih)
D II.10-5 Circula Curled Umbon Trans Halus Non
r ate paran mengkil pigment
t ap asi
E I.10-5, Funcif Entire Flat Opaq Halus Pigment
II.10-5, orm ue mengkil asi
I.10-7 ap (putih)
F I.10-5, Anaero Opaq Halus Pigment
II.10-5 b ue mengkil asi
fakulta ap (putih)
tif
G I.10-5, Circula Entire Flat Opaq Halus Pigment
-6
I.10 , r ue mengkil asi
-6
II.10 ap (putih)
H I.10-6 Irregul Erose Umbon Opaq Halus Pigment
ar ate ue mengkil asi
ap (putih)
I I.10-6 Irregul Erose Umbon Trans Halus Pigment
ar ate paran mengkil asi
t ap (putih)
 B

Gambar 4.2 Hasil Isolasi pada Pengenceran I.10-5

G
=

Gambar 4.3 Hasil Isolasi pada Pengenceran II.10-5

 C

Gambar 4.4 Hasil Isolasi pada Pengenceran I.10-5

Tabel 4.3 Hasil Pemurnian Menggunakan Metode Streak pada Cawan Petri.
Cawan Hasil/Gambar Morfologi koloni
I (Afidah) A
 Cawan Hasil/Gambar Morfologi koloni
II (Desi)

III (Elly) A

IV (Khafidz) A

V (Trias) A

Tabel 4.4 Hasil Streak pada Tabung Reaksi

Streak tabung Tidak
Afidah I tumbuh

Streak tabung Tumbuh tidak

Afidah II kontam

Streak tabung Tumbuh tidak

Desi I kontam
Streak tabung Tumbuh tidak
Desi II kontam

Streak tabung Tumbuh tidak

Elly I kontam

Streak tabung Tumbuh tidak

Elly II kontam
Streak tabung Tumbuh tidak
Khafidz I kontam

Streak tabung Tumbuh tidak

Khafidz II kontam

Streak tabung Tumbuh tidak

Trias I kontam
 Streak tabung Tumbuh tidak
Trias II kontam

4.2 Analisis dan Pembahasan

A. Isolasi, Enumerasi, Purifikasi
Berdasarkan data pada Tabel 4.1 dan grafik pada Gambar 4.1 tersebut,
dapat dilihat bahwa sampel tanah yang mengandung bakteri paling banyak
adalah pada tanah rizosfer alamanda dengan nilai SPC sebesar 1,7 x 107
sedangkan tanah yang mengandung bakteri paling sedikit adalah tanah
rizosfer asoka dengan nilai SPC 0,55 x 10 7. Perbedaan jumlah bakteri per 1
gram sampel tanah tidak lepas dari beberapa faktor lingkungan yang
mendukung. Seperti dijelaskan sebelumnya bahwa ada beberapa faktor yang
mempengaruhi banyaknya mikroorganisme yang ditemukan pada rizosfer
yaitu karena suhu, pH, kelembaban, nutrisi dan kondisi tanaman berkaitan
dengan metabolisme yang dihasilkan oleh tanaman seperti eksudat, sekret,
lisat, lendir dan mucigel. Daerah sekitar perakaran relatif kaya akan
nutrisi/unsur hara. Perpindahan hasil fotosintesis dari daun ke akar
merupakan bagian dari metabolisme pada tumbuhan sehingga bisa
dimungkinkan bahwa bakteri-bakteri yang ditemukan dekat dengan perakaran
merasa tertarik karena adanya nutrisi yang cukup melimpah. Konsekuensinya
dukungan rizosfer berpengaruh terhadap pertumbuhan tanaman karena
adanya bakteri baik bakteri yang bermanfaat ataupun merugikan (Backer
dkk;2013).
Berdasarkan Tabel 4.2 diatas didapatkan berbagai macam koloni bakteri,
Terdapat 9 koloni bakteri yang diberi tanda huruf setiap koloni yang sudah
terkarakterisasi secara morfologi koloni-koloni bakteri tersebut ialah koloni
A, B, C, D, E, F, G, H, I. koloni-koloni tersebut tersebar merata dengan
jumlah yang berbeda dari hasil pengenceran ke 10 -5, 10-6 dan 10-7. Dari data
tersebut dapat diperkirkan tanah rizhosfer pohon angsana minimal memiliki
keanekaragaman 9 jenis bakteri tersebut yang memiliki karakteristik
morfologi yang berbeda-beda. Keanekaragaman tersebut paling banyak
ditemukan pada pengenceran 10-5 dan hampir semua jenis bakteri tersebut
tumbuh di pengenceran ini, keanekaragaman ini semakin sedikit hingga
pengenceran 10-7. pada pengenceran ini hanya ditemukan beberapa koloni saja
(koloni A dan B) dan dalam jumlah yang sangat sedikit. Perubahan
keanekaragaman tersebut lebih dipengeruhi oleh pengenceran. Pengenceran
ini dilakukan untuk mengetahui perkiraan jumlah koloni bakteri dan juga
dilakukan agar koloni bakteri yang tumbuh pada agar nutrisi tidak terlalu
padat dan memudahkan dalam pengidentifikasian bakteri (Dwipayana dan
Ariesyadi; 2009). Sehingga koloni-koloni tersebut lebih mudah untuk
dihitung dan dikarakterisasi secara morfologi.
Sebagian koloni bakteri pada pengenceran I.10 -6, II.10-6, I.10-7 dan II.10-7
kurang terlihat jelas pada gambar sehingga tidak dapat ditampilkan semua
jenis koloni per pengenceran.
Setelah mengumpulkan data mengenai karakteristik morfologi koloni,
tahap selanjutnya adalah memurnikan bakteri untuk mendapatkan satu koloni
tunggal yang dipilih dari berbagai jenis koloni pada salah satu isolat. Pada
mikrobiologi, teknik isolasi biakan murni dilakukan dengan metode streak
plate yang selanjutnya bakteri ditumbuhkan pada wadah atau plate baru
(Boundless, 2016).
 Dalam praktikum ini, streak dilakukan pada cawan petri dan tabung reaksi.
hasil streak pada cawan petri yang berhasil akan menghasilkan satu koloni
terpisah pada kuadran ke 3 atau ke 4. Prinsip dari metode streak adalah
didapatkan biakan murni salah satu koloni bakteri yang terpisah dari koloni
lain (Amrita, 2011) sehingga jika didapatkan koloni bakteri yang terpisah
namun masih pada kuadran 1 atau 2 maka praktikum tetap berhasil karena
sesuai dengan prinsip metode streak. Pada praktikum ini, hasil pemurnian
bakteri pada 5 cawan bakteri semuanya berhasil. Hasil dapat terlihat pada
Tabel 4.3 berupa gambar hasil pemurnian dalam cawan petri.
Koloni bakteri A paling banyak digunakan untuk pemurnian karena
berhubungan dengan karakteristik morfologinya yang paling mudah diamati
karena opaque tidak transparan, mudah saat isolasi dari wadah satu ke wadah
lain, berada di permukaan agar tidak berada di dalam agar, ukurannya tidak
terlalu kecil saat dimurnikan.
Setelah melakukan streak pada cawan petri, selanjutnya memurnikan
bakteri pada tabung reaksi dengan metode yang sama. Streak tabung reaksi
dilakukan sebanyak 2 kali untuk peremajaan bakteri. Hasil pemurnian pada
tabung reaksi dapat dilihat pada Tabel 4.4.
Berdasarkan hasil streak pada cawan dan tabung reaksi, hasil pemurniaan
koloni bakteri tidak semuanya maksimal. Ada beberapa faktor yang
menyebabkan hasil streak tidak tumbuh, ada pertumbuhan namun tidak baik
atau pada kemungkinan terburuk yaitu kontaminasi adalah karena lupa
melakukan teknik aseptik sebelum dan sesudah melakukan isolasi dan
pemurnian, lupa memanaskan loop (ose) saat memindahkan bakteri dari
cawan satu ke cawan lain menyebabkan bakteri atau spora di udara berpotensi
tumbuh dalam media, lupa mendinginkan ose sebelum mengambil inokulan
sehingga bakteri mati sebelum di-streak, lupa mensterilkan ose setiap pindah
kuadran sehingga menyebabkan terbentuk hasil yang masih tebal, membuka
tutup terlalu lama, dan lain-lain yang memicu terjadinya kontaminan
(Caprette, 2015). Terlihat pada gambar bahwa ada hasil streak yang banyak
mengandung air, hal tersebut dikarenakan terjadi pengembunan saat
dimasukkan dalam freezer sehingga perkembangbiakan bakteri semakin
 tinggi dan tidak mengikuti alur streak. Sesuai dengan faktor tumbuh pada
bakteri yaitu akan tumbuh pada ketersediaan air mencukupi.
B. Nutrisi yang Dibutuhkan dalam Media Tumbuh Isolasi Bakteri Rizosfer
Ada banyak bahan di media yang kompleks, yang meliputi ekstrak
ragi, tryptone, dan lain-lain. Pentingnya media kompleks adalah bahwa
mereka akan mendukung pertumbuhan berbagai organisme mikro. Agar
diperoleh dari ganggang merah di mana ia adalah suplemen polisakarida
(asam polygalacturonic) di dinding sel mereka. Agar bukan komponen gizi,
tetapi agen pemadatan lebih baik karena larut di atau dekat suhu didih (100
C) tapi membeku pada 45 C. Saat memadat, ia akan menjebak sel-sel
bakteri yang hidup agar lebih mudah mengkarakterisasinya (Amrita, 2011).
Penggunaan media juga tergantung pada tujuan penelitian. Sehingga
kebutuhan nutrisi dalam media juga disesuaikan dengan tujuan penelitian.
Salah satu contoh, pada umumnya bakteri pada tanah mengikat nitrogen dan
karbon dari dalam tanah. Oleh karena itu, untuk menumbuhkan bakteri tanah
dengan tujuan memperoleh bakteri seperti di atas maka dapat menggunakan
media Simmons Sitrat, yaitu media yang digunakan untuk menumbuhkan
bakteri yang mengikat karbon dan nitrogen (BISC, 2013). Pada praktikum
kali ini karena tujuannya untuk melihat morfologi koloni pada sampel yang
kemungkinan memiliki keanekaragaman bakteri cukup banyak maka
digunakan media umum.
C. Peran Bakteri Rizosfer Bagi Tanah dan Tumbuhan
Bakteri pembantu pertumbuhan tanaman (Plant Growth Promoting
Rizhobacteria) tumbuh secara berkoloni dengan sangat efisien. Mereka
melakukan fungsi penting untuk memenuhi kesehatan dan pertumbuhan
tanaman dalam berbagai cara. Selanjutnya hubungan simbiosis dengan
tanaman mengarah pada manfaat bagi tanaman dan bakteri seperti penyerapan
nutrisi yang lebih baik dan stimulasi pertumbuhan akar. Bakteri rizosfer juga
berperan dalam modifikasi kimia dan fisika yang secara langsung
mempengaruhi tanaman. Secara kimia, dalam hal ini bakteri rizosfer berperan
mengurangi Mangan dan Besi yang merupakan nutrisi penting yang juga
berperan saat sintesis lignin, sehingga meningkatkan resistensi dari patogen
tanah yang dilindungi oleh akar tanaman (Osorio, 2007). Perubahan fisik
terjadi terutama melalui produksi zat polimer ekstraseluler, seperti
polisakaridan dan glomalin yang meningkatkan agresi tanah dan tekstur
tanah. Namun tanaman juga dapat bersaing dengan mikroorganisme untuk
sumber daya seperti air dan nutrisi terutama jika bakteri tidak bersifat
simbiotik (Hinsinger dkk; 2009).
 BAB V

KESIMPULAN

5.1 Kesimpulan

1. Sampel tanah rizosfer yang mengandung jumlah bakteri paling tinggi

berdasarkan metode Standard Plate Counting adalah tanah rizosfer
Alamanda yaitu 1,7 x 107 CFU/ml per satu gram sampel sedangkan
jumlah bakteri terendah ditemukan pada tanah rizosfer Asoka sebesar 0,55
x 107 CFU/ml.
2. Perbedaan jumlah bakteri pada sampel tanah rizosfer yang berbeda
diakibatkan karena pengaruh lingkungan dan hasil metabolisme sekunder
dari tanaman satu dengan lainnya kemungkinan berbeda.
3. Penggunaan media tumbuh untuk bakteri rizosfer tergantung pada tujuan
penelitian. Sehingga kebutuhan nutrisi dalam media juga disesuaikan
dengan tujuan penelitian. Pada praktikum kali ini karena tujuannya untuk
melihat morfologi koloni pada sampel yang kemungkinan memiliki
keanekaragaman bakteri cukup banyak maka digunakan media umum.
4. Hasil pengenceran pada sampel tanah rizosfer Angsana menemukan 9 jenis
koloni bakteri dengan karakteristik morfologi yang beraneka ragam, koloni
paling banyak ditemukan pada pengenceran ke-5.
5. Hasil pemurnian menggunakan metode streak cawan dan tabung berhasil
meskipun didapatkan hasil yang kurang bagus, namun sudah dapat
memperoleh koloni tunggal.
6. Peran bakteri bagi tanah dan tanaman adalah bakteri bisa bersimbiosis
dengan tanah dan tanaman karena adanya senyawa metabolit dari tanaman
serta bakteri bisa juga tidak menguntungkan bagi tanaman karena bisa
sebagai kompetitor.

5.2 Saran

1. Sebaiknya dalam bekerja dalam laboratorium memperhatikan efisiensi

waktu mengingat praktikum mikrobiologi dasar banyak hal yang harus
dilakukan dengan tepat dan cepat.
2. Lebih berhati-hati dalam menggunakan alat-alat di laboratorium.
3. Selalu memperhatikan teknik aseptik dan prosedur praktikum agar hasil
dapat maksimal dan tidak terkontaminasi.
 DAFTAR PUSTAKA

Amrita University. 2011. Streak Plate Method. http://vlab.amrita.edu/?

sub=3&brch=73&sim=213&cnt=1. Diakses pada tanggal 15 Maret 2016
pukul 20.21 WIB.
Asri, Mahanani Tri, dkk. 2016. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar:
Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA Unesa.
Bakker, Peter A. H. M., Roeland L. Berendsen, Rogier F. Doornbos, Paul C. A.
Wintermans, and Corn M. J. Pieterse. 2013.The Rhizosphere Revisited:
Root Microbiomics. Frontiers in Plant Science 4.
doi:10.3389/fpls.2013.00165.
BISC. 2013. Culture Media.
http://openwetware.org/wiki/BISC209/S13:_Culture_Media. Diakses pada
tanggal 15 Maret 2016 pukul 20.30 WIB.
Boundless. 2016. Aseptic Technique, Dilution, Streaking, and Spread Plates.
Boundless Microbiology. Boundless, 21 Jul. 2015. from
https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-
textbook/culturing-microorganisms-6/culturing-bacteria-58/aseptic-
technique-dilution-streaking-and-spread-plates-367-7652/ diakses pada
tanggal 15 Mar. 2016 pukul 13.00 WIB.
Caprette, David R. 2015. Strategies for Obtaining Pure Isolates. Rice University
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/bios318/pure.htm diakses pada tanggal 15
Maret 2016 pukul 16.15 WIB.
Dwipayana dan Herto Dwi Ariesyady. 2009. Identifikasi Keberagaman Bakteri
pada Lumpur Hasil Pengolahan Limbah Cat dengan Teknik Konvensional.
Fakultas Teknik Sipil dan Lingkungan. Institut Teknologi Bandung.
Hanafiah, Kemas Ali, A. Napoleon dan Nuni Ghofar. 2005. Biologi Tanah:
Ekologi dan Mikrobiologi Tanah. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada.
Hartsock, Angela. 2016. Serial Dilution in Microbiology Calculation Method
Technique. http://study.com/academy/lesson/serial-dilution-in-microbiology-
calculation-method-technique.html diakses pada tanggal 14 Maret 2016 pukul
12.15 WIB.
Hinsinger, P., Bengough, A. G., Vetterlein, D., & Young, I. M. 2009. Rhizosphere:
Biophysics, biogeochemistry and ecological relevance. Plant Soil Plant and
Soil, 321(1-2), 117-152
Kusnadi dkk. 2012. Buku Common text mikrobiologi. Universitas Pendidikan
Indonesia, Jakarta.
Osorio Vega, N. W. 2007. A review on beneficial effects of rhizosphere bacteria
on soil nutrient availability and plant nutrient uptake. SciELO, 60(1).
Prayudyaningsih, Retno, Nursyamsi dan Ramdana Sari. 2015. Mikroorganisme
Tanah Bermanfaat pada Rizosfer Tanaman Umbi Tegakan Hutan Rakyat
Sulawesi Selatan.Proseding Seminar Nasional Masyrakat Biodiversiti
Indonesia Vol 1, nomor 4, juli 2015 halaman:954-959.
Simanungkalit, RDM, Suriadikarta DA. 2006. Pupuk Organik Dan Pupuk Hayati.
Balai Besar Penelitian Dan Pengembangan Sumber Daya Lahan Pertanian.
Bogor.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta
 LAMPIRAN
Dokumentasi Pengenceran