Jianmin Gao; Haibo Weng; Yu Xi; Daheng Zhu and

Shaoyin Han

Presented by:
SILVI IKAWATI

What is genetic transformation?

Plant transformation
A commonly

accepted definition of plant transformation is: "the

introduction of exogenous genes into plant cells, tissues or
organs employing direct or indirect means developed by
molecular and cellular biology" (Alves et al, 1999).

Transformation

methods can be divided into two main groups:

indirect and direct ones. The indirect methods of plant
transformation are based on the introduction of a plasmidcarrying gene construct into the target cell by means of bacteria
Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
Direct methods do not use bacteria cells as mediators,

DNA Vektor

DNA vektor adalah molekul DNA

yang secara khusus dirancang
untuk membawa molekul DNA
yang akan dimasukkan ke dalam
jasad target.

Struktur dasar tersebut dapat

berupa plasmid alami yang berasal
dari suatu bakteri atau berupa
DNA virus tertentu.

Plasmid alami atau DNA virus

tersebut kemudian dimodifikasi
dengan menambahkan komponenkomponen genetik lainnya.

DNA Vektor

Komponen-komponen penting suatu DNA vektor adalah:

1.
2.
3.
4.

Ori (origin of replication, titik awal replikasi).

Sisi penyisipan fragmen DNA asing,
Penanda genetik,
Sinyal transkripsi dan translasi

Transformasi dengan
perantaraan Agrobacterium

Kemampuan Agrobacterium mentransfer material gen yang dinginkan ke

tanaman target disebabkan oleh adanya T-DNA dari plasmid yang terdapat
pada Agrobacterium yang dapat diinsersikan ke inti sel tanaman dan material
gen tersebut bergabung secara stabil dengan genom tanaman (Iker et al.,
2008; Yuwono, 2008; Muslim, 2009).

Infeksi merupakan salah satu tahap dalam proses transfer gen menggunakan
Agrobacterium. Dalam proses infeksi, ruas T-DNA dipindahkan dari sel bakteri
Agrobacterium ke dalam sel tanaman (Utomo, 2004).

Agrobacterium tumefaciens ialah bakteri tanah yang dapat menyebabkan

penyakit tumor pada beberapa tanaman.

Transformasi dengan
perantaraan Agrobacterium

Gen-gen yang
bertanggungjawab untuk
transfer T-DNA juga
terdapat dalam plasmid Ti
yang disebut gen-gen
virulen (gen vir).

Sebelum vektor plasmid Ti

digunakan untuk
mentransfer gene asing,
maka gen-gen yang akan
mengekspresikan
pembentukan tumor harus
dinon-aktifkan atau
dibuang.

Transformasi dengan
perantaraan Agrobacterium
Metode Transformasi In planta
a.

Pada kebanyakan metode konvensional menggunakan A.

tumefaciens, pertama-tama A. tumefaciens diinokulasikan
pada jaringan mengandung embrionik sel yang aktif
membelah seperti embrio muda dan kalus dalam sistem
kultur jaringan. Kemudian, A. tumefaciens dihilangkan
menggunakan antibiotik dan tanaman tertransformasi
diseleksi dengan media selektif. Terakhir, tanaman
diregenerasi dengan media tertentu.

10

Transformasi dengan
perantaraan Agrobacterium
Metode Transformasi In planta
b. Suatu metode transformasi in planta untuk tanaman
Arabidopsis telah dapat diterima dan dilakukan
secara luas yang disebut dengan metode floral dip.
Metode ini cukup sederhana; tanaman ditumbuhkan
hinga fase berbunga, dicelupkan ke dalam suspensi
Agrobacterium, dan ditumbuhkan hingga dewasa, dan
kemudian biji-biji yang dihasilkan dipanen dan
dikecambahkan pada media seleksi untuk
mendeteksi tanaman tertransformasi.
11

Teknik Biolistik

Dalam teknik ini sel atau jaringan tanaman

ditembaki dengan alat penembak
mikroproyektil yang membawa DNA
rekombinan.

Microcarrier mengandung partikel tungsten

yang dilapisi dengan DNA yang akan
ditembakkan

Penembakaan dilakukan dengan

mengalirkan gas helium pada kecepatan
tinggi

Pellet mikro yang mengandung DNA

tersebut kemudian dapat melewati stopping
plate dan menembus sel atau jaringan yang
ada di bawahnya.

12

13

Elektroporasi

Elektroporasi adalah suatu teknik

untuk memasukkan DNA ke dalam
sel dengan cara memberikan
pulse listrik pada voltase tinggi
dalam waktu singkat.

Metode elektroporasi adalah

mekanisme yang efektif untuk
mentransfer DNA secara cepat ke
dalam serbuk sari
14

Serbuk saritarget untuk

transfer gen

Figure.
Pollen
transformatio
n (Eapen,

Serbuk sari merupakan

target ideal untuk
transformasi, karena
berjumlah besar, dapat
dengan mudah
dikumpulkan dari anter
dan transgen dapat
dimasukkan secara
langsung dalam bentuk
potongan DNA atau
melalui vektor
Agrobacterium
15

Analisis DNA rekombinan

Analisis keberadaan DNA rekombinan di
dalam sel yang ditransformasi dapat
dilakukan dengan:
1.

Analisis restriksi DNA

Dilakukan dengan terlebih dahulu

mengisolasi DNA dari koloni-koloni
transforman yang tumbuh pada medium
selektif. Setelah dilakukan isolasi DNA
plasmid, maka selanjutnya DNA tersebut
dipotong dengan suatu enzim restriksi
yang spesifik.

Hasil pemotongan DNA tersebut kemudian

dielektroporesis pada gel agarose
sehingga diperoleh pita-pita DNA.

16

Analisis DNA rekombinan

2. Hibridisasai dengan pelacak DNA (DNA probe)

Pelacak DNA adalah suatu molekul DNA yang biasanya

berukuran pendek dan dilabel dengan radioaktif atau
dengan molekul non-radioaktif, misalnya dioxigenin.

Urutan DNA pelacak dibuat sedemikian rupa sehingga

mempunyai kemiripan dengan urutan nukleotida DNA
rekombinan yang akan dilacak.

Jika diantara koloni-koloni ada DNA yang mempunyai

kemiripan dengan pelacak, maka akan terjadi hibridisasi
antara DNA target dengan DNA pelacak.

17

Analisis DNA rekombinan

1. Analisis
a.

ekspresi gen asing

Salah satu teknik analisis ekspresi gen asing adalah dengan

menggunakan antibodi yang dibuat dengan protein yang
dikode oleh gen asing tersebut sebagai antigen.

b. Selain itu salah satu penanda genetik yang sering digunakan

adalah gen yang mengkode sintesis enzim luciferase (enzim
yang ada dalam tubuh kunang-kunang yang dapat
menyebabkan pendar cahaya hijau).
18

Analisis DNA rekombinan

c. GFP is a stable, cell autonomous
fluorescent protein derived from
jellyfish (Aequorea victoria). It has
been extensively used as a non
destructive reporter gene for plant
transformation (Chiuetal.,1996). After
30 d of cocultivation, GFP expression
was evident in calli Figure3A).
Nontransformed tissue from original
explants did not express green
fluorescence, and explant growth was
suppressed (Figure3B). Leaves of
transformed plantlets also expressed
GFP, and the green fluorescence was
easily detectable with blue light
illumination of calli(Figure3C). (D-F) Glucuronidase (GUS) expression in
transformed callus, leaflet, and stem.
19

Analisis DNA rekombinan

d. Pengklonan fragmen gen tertentu ke dalam plasmid pGEM T
Easy
Contoh Keberhasilan penyisipan gen ke dalam pGEM T Easy
dan introduksi pGEM T Easy rekombinan ke E. coli ditunjukkan
oleh adanya koloni putih yang dapat tumbuh pada media seleksi
yang mengandung antibiotik ampisilin, IPTG dan X-gal.
Gen lacZ menyandi -galactosidase (-gal) yang mengubah substrat
X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru bila ada IPTG
yang berfungsi menginduksi promoter lacZ. Bila fragmen GmMt2
menyisip pada gen lacZ, maka gen lacZ tidak dapat diekspresikan
sehingga koloni E. coli berwarna putih.

20

Analisis DNA rekombinan

4.

Amplifikasi DNA dengan teknik

PCR

Primer yang digunakan dapat

berupa oligonukleotida yang
komplemeter dengan fragmen DNA
asing.

Hasil amplifikasi DNA tersebut

kemudian dielektroporesis pada gel
agarose sehingga diperoleh pitapita DNA.

21

Analisis DNA rekombinan

5. Penentuan

urutan nukleotida (DNA sequencing)

Untuk lebih memastikan keberadaan DNA asing di

dalam vektor rekombinan adalah dengan melakukan
penentuan urutan nukleotida fragmen DNA asing
tersebut.

22

Methods
Cloning DNA fragments menggunakan
vector untuk amplifikasi
pC1380 (vector ekspresi) -35SDhPEX11 Construct
Melon Transformation
Planting
Molecular analysis
Stress-tolerance assay of
transformed plants
24

Teknologi DNA Rekombinan

Untuk melakukan rekombinasi DNA secara in vitro, maka perlu
dilakukan beberapa tahapan dasar yaitu:
(1). Isolasi molekul DNA (gen) yang akan digabungkan,
(2). pemotongan DNA dengan menggunakan enzim
endonuklease restriksi.
(3). Penyambungan molekul-molekul DNA dengan
menggunakan enzim DNA ligase ke dalam suatu molekul
DNA vector,
(4). Transformasi sel inang dengan DNA rekombinan hasil ligasi,
(5). Analisis dan konfirmasi keberadaan DNA rekombinan dalam
sel inang,
(6). Karakterisasi fungsional gen yang diklon.

25

Isolasi DNA

26