PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LAKASE T.

asperellum
LBKURCC1 PADA BEBERAPA VARIASI pH dan SUHU
MENGGUNAKAN MICROPLATE READER λ 405 nm

Afmeritha Cheline*, Andi Dahliaty2

Mahasiswa Program S1 Kimia
1

2
Dosen Bidang Biokimia Jurusan Kimia
1,2
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau
Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
*afmeritha.cheline4086@student.unri.ac.id
ABSTRACT
Laccase (EC 1.10.3.2, p-diphenol:dioxygen oxidoreductase) is a copper-
containing polyphenol oxidase. The laccase enzyme can be produced by fungi.
One of the fungi is Trichoderma asperellum. T. asperellum LBKURCC1 is one
of the fungi that isolated from the cocoa plantations. The activity of the laccase
enzyme is influenced by several factors, including pH and temperature. The
purpose of this research was to determine the activity of the laccase enzyme at
various pH and temperature using a microplate reader λ 405 nm. In this research,
laccase was partially purified by the precipitation method of ammonium sulfate
20-80% and dialysis using ultrafiltration centrifugation (UF) with a membrane of
30,000 Dalton Molecular Weight Cut Of (MWCO) and the activity of the laccase
enzyme was tested using the Microplate reader method. Based on this research,
the highest activity of the laccase enzyme T. asperellum LBKURCC1 on ABTS
was found to be at optimum pH (5.5 and 4.0) and an optimum temperature of
45oC, giving a laccase activity of (65.16 ± 14.26 and 59.83 ± 5.25) and
(224.66 ± 17.39) U/L respectively.
Keyword: activity, enzyme, laccase, trichoderma

ABSTRAK
Lakase (EC 1.10.3.2, p-difenol: dioksigen oksidoreduktase) adalah polifenol
oksidase yang mengandung tembaga. Enzim lakase dapat dihasilkan oleh
jamur. Salah satu jamur yang dapat menghasilkan enzim lakase adalah jamur
T. asperellum. T. asperellum LBKURCC1 ini merupakan salah satu jamur yang
diisolasi dari perkebunan kakao. Aktivitas enzim lakase dipengaruhi oleh
beberapa faktor, diantaranya yaitu pH dan suhu. Tujuan dari penelitian ini adalah
menentukan aktivitas enzim lakase pada beberapa variasi pH dan suhu
menggunakan microplate reader λ 405 nm. Pada penelitian ini, lakase
dimurnikan sebagian dengan metode pengendapan garam ammonium sulfat
20-80% dan didialisis menggunakan sentrifugasi ultrafiltrasi (UF) dengan

1
membran 30.000 Dalton Molecular Weight Cut Of (MWCO) dan aktivitas
enzim lakase di uji menggunakan Microplate Reader. Aktivitas tertinggi
enzim lakase T. asperellum LBKURCC1 terhadap ABTS diperoleh pada pH
(5,5 dan 4,0) dan suhu 45oC dengan nilai aktivitas masing-masing sebesar
(65,16 ± 14,26 dan 59,83 ± 5,25) U/L dan 242,66 ± 29,79 U/L.

Kata kunci: aktivitas, enzim, lakase, trichoderma

PENDAHULUAN optimum enzim lakase berkisar

Lakase (EC 1.10.3.2, p-difenol: antara 3,0-7,0 dan suhu
dioksigen oksidoreduktase) adalah optimum enzim lakase berkisar
polifenol oksidase yang mengandung antara 35-60 C (Husna et al., 2017).
o

tembaga. Lakase tersebar luas pada Pada penelitian ini

tanaman dan mikroorganisme menggunakan ekstrak kasar
(Baldrian, 2016). Salah satu jamur enzim lakase dari T. asperellum
yang dapat menghasilkan enzim LBKURCC1(Laboratorium Biokimia
lakase adalah jamur T. asperellum. Universitas Riau Culture
Jamur ini mudah ditemui dilahan Collection I) yang merupakan
pertanian dan perkebunan. Enzim isolat yang disimpan di
lakase memiliki potensi besar Laboratorium Riset Enzim,
dibidang bioteknologi dan banyak Fermentasi dan Biomelekuler,
diaplikasikan dalam bidang industri Jurusan Kimia, Fakultas Matematika
seperti degradasi warna limbah, dan Ilmu Pengetahuan Alam,
delignifikasi pulp, dan bioremediasi Universitas Riau. T. asperellum
(Iwara et al., 2021). LBKURCC1 di isolasi dari rizosfer
Aplikasi enzim lakase pada perkebunan cokelat di Kecamatan
berbagai bidang industri memerlukan Rumbai, Kota Pekanbaru, Provinsi
produksi yang besar dengan biaya Riau (Nugroho et al., 2020).
yang rendah. Pengurangan biaya Ekstrak kasar enzim lakase dari
produksi enzim lakase dapat T. asperellum LBKURCC1
dilakukan dengan pemilihan dilakukan pemurnian dengan
mikroorgnisme yang tepat, pengendapan garam ammonium
optimisasi medium fermentasi, sulfat pada konsentrasi 20-80%.
penambahan inducer, optimisasi Dilanjutkan dengan pemisahan
kondisi proses seperti pH dan suhu. menggunakan membran ultrafiltrasi
Aktivitas suatu enzim dipengaruhi 30.000 Dalton Moleculer Weight
oleh beberapa faktor, salah satunya Cut Off (MWCO) dan dilakukan
pH dan suhu. Setiap enzim memiliki penentuan ativitas enzim lakase
suhu dan pH tertentu untuk dapat pada beberapa variasi pH dan
melakukan aktivitasnya secara temperatur. Uji aktivitas enzim dapat
maksimal (Gustina et al., 2018). pH dilakukan menggunakan microplate

2
reader dan spektrofotometri throughput sampel yang tinggi
UV-Vis. Pengukuran aktivitas dan kemudahan penggunaannya
enzim lakase menggunakan (Durand et al., 2012).
spektrofotometri UV-Vis telah Oleh karena itu, pada penelitian
dilakukan oleh Nadyani (2022), ini menggunakan metode microplate
yang merupakan salah satu reader untuk menentukan aktivitas
anggota tim penelitian dalam enzim lakase pada beberapa variasi
penentuan aktivitas optimum enzim pH dan temperatur. Dengan
lakase pada variasi pH dan suhu. digunakannya metode ini dapat
Telah dilaporkan oleh Sudarson mempercepat proses analisis
(2014) bahwa microplate reader dalam penelitian yang biasanya
dapat digunakan untuk mengukur jika menggunakan spektrofotometri
aktivitas enzim. Alat ini banyak membutuhkan waktu analisis
digunakan dalam ilmu biologi, tetapi sampel 1-2 jam, sedangkan dengan
penggunaannya dalam lingkungan menggunakan metode microplate
kimia di Laboratorium Riset Enzim, reader hanya membutuhkan
Fermentasi dan Biomelekuler, waktu 15-20 menit untuk analisis
Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas sampel, lebih praktis dan
Riau, masih terbatas. ekonomis. Sehingga lebih efesien
Microplate reader atau yang dan mempermudah peneliti dalam
disebut sebagai Enzyme- linked melakukan pengukuran suatu
Immunosorbent Assay (Elisa) reader sampel selama melakukan
merupakan alat yang digunakan penelitian.
untuk mengukur nilai absorbansi
suatu sampel, salah satu sampel METODOLOGI PENELITIAN
yang digunakan adalah protein a. Alat dan bahan
(Santoso et al., 2021). Penentuan Alat yang digunakan untuk
aktivitas enzim pada beberapa variasi melakukan penelitian ini adalah
pH dan temperatur menggunakan pipet mikro (Socorex Acura 825,
microplate reader belum pernah pH meter (HORIBA Scientific),
diuji di Laboratorium Riset Enzim, timbangan analitik, waterbath
Fermentasi dan Biomolekuler, (Sibata waterbath WK-24),
Jurusan Kimia, Universitas Riau. membran ultrafiltrasi 30.000 Dalton
Keuntungan dari menggunakan MWCO (Moleculer Weight Cut
microplate reader ini dapat off), pipet Multi Channel,
melakukan analisis dengan volume Microplate Reader (Berthold
sampel yang sedikit sehingga TriStar 1941) λ 405 nm, microwell
lebih praktis dan ekonomis, plate dan alat-alat gelas
jumlah variasi sampel yang laboratorium lainnya yang
banyak sehingga lebih menghemat digunakan sesuai prosedur kerja.
waktu dalam proses analisis,

3
 Bahan-bahan yang digunakan Endapan yang telah didapatkan
dalam penelitian ini adalah enzim dari hasil fraksinasi dengan garam
lakase yang berasal dari isolat ammoniun sulfat dilarutkan dengan
jamur Trichoderma asperelloides 150 mL bufer Asetat 0,05 M pH 5,5
LBKURCC1 koleksi Laboratorium dan didialisis dengan membran
Riset Enzim, Fermentasi, dan ultrafiltrasi yang memiliki 30.000
Biologi molekuler, Jurusan Kimia, Dalton (30 kDa) Molecular Weight
Fakultas Matematika dan Ilmu Cut Of (MWCO), disentrifugasi
Pengetahuan Alam, Universitas dengan kecepatan 9.000 rpm selama
Riau, garam ammonium sulfat 10 menit pada suhu dingin dan di
((NH4)2SO4) (SIGMA Aldrich A cuci beberapa kali dengan bufer
4418-5006), asam asetat glasial Asetat 0,05 M pH 5,5 hingga
(CH3COOH), natrium asetat didapatkan enzim berwarna bening
(CH3COONa), disodium phosfat kekuningan.
(Na2HPO4), monosodium phospat
(NaH2PO4), ABTS (2,2-Azinobis 3- d. Uji aktivitas enzim terhadap
ethyl benzothiazoline 6- sulfonic variasi pH
acid) (SIGMA A1888) dan aqua Penentuan aktivitas enzim lakase
DM. dilakukan pada suhu ruang 30C
dengan variasi pH (buffer asetat
b. Fraksinasi menggunakan garam 4,0; 4,5; 5,0; 5,5) dan (buffer
ammonium sulfat fosfat 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0)
Ekstrak kasar enzim lakase dari menggunakan substrat 2,2’-
jamur T. asperellum LBKURCC1 azinobis-3- etilbenzothiazoline- 6-
sebanyak 100 mL ditambahkan asam sulfonate (ABTS) yang
garam ammonium sulfat dengan diukur menggunakan microplate
kejenuhan 20-80%. Diaduk reader (Berthold TriStar 1941) pada
menggunakan magnetic stirrer panjang gelombang 405 nm dengan
pada suhu dingin selama 1 jam interval waktu 0 dan 5 menit. 180
(larut). Larutan dimasukkan µL buffer asetat pH 4,0 dan 10 µL
kedalam tabung sentrifugasi. enzim lakase dimasukkan kedalam
Larutan disentrifugasi dengan 96-sumur (microwell plate) 180 µL
kecepatan 12.000 rpm selama 10 buffer asetat pH 4,0 dan 10 µL
menit, sehingga diperoleh endapan enzim lakase dimasukkan
dan supernatan kemudian kedalam 96-sumur (microwell
dipisahkan. Sehingga diperoleh plate). Sebagai kontrol digunakan
endapan berwarna kuning enzim terdenaturasi. Hal yang
kecoklatan. sama dilakukan sebanyak 5 kali
pengulangan dengan variasi pH 4,0;
c. Pemurnian menggunakan 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan
membran ultrafiltrasi 8,0.

4
e. Uji aktivitas enzim terhadap
variasi suhu
Penentuan aktivitas enzim lakase
dilakukan pada variasi suhu 30; 35;
40; 45; 50; 55; dan 60oC
menggunakan larutan buffer dengan
pH optimum yang telah diperoleh
dari uji sebelumnya dan ABTS
sebagai substrat. Larutan sampel dan
kontrol terdiri dari buffer 180 µL
dan 10 µL ABTS dimasukkan
kedalam eppendorf dan diinkubasi
menggunakan water bath selama 5
menit. Kemudian ditambahkan 10
µL enzim lakase kedalam larutan
sampel dan 10 µL enzim
terdenaturasi kedalam larutan
kontrol. Larutan dimasukkan
kedalam 96-sumur (microwell
plate) menggunakan micropipet
multi channel dan diukur
absorbansinya menggunakan
microplate reader (Berthold TriStar
1941) pada panjang gelombang 405
nm untuk waktu 0 menit. Hal yang
sama juga dilakukan untuk waktu 5
menit. Kemudian dilakukan
sebanyak 5 kali pengulangan pada
suhu yang akan ditentukan.
f. Analisis data
Data aktivitas enzim pada variasi
pH dan suhu dianalisis secara
statistic menggunakan tes Anova dan
dilanjutkan dengan tes Duncan jarak
berganda dengan taraf 5 %
menggunakan program SPSS dan
disajikan dalam bentuk tabel dan
grafik.
HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Pengaruh pH terhadap aktivitas
enzim lakase
Penentuan aktivitas enzim lakase
dilakukan pada beberapa variasi pH,
yaitu pH (buffer asetat 4,0-5,5 dan
buffer fosfat 6,0-8,0) pada interval
pH 0,5 pada suhu kamar (30oC).
Hasil yang diperoleh ditunjukkan
pada Gambar 1. dan Tabel 1.
Aktivitas enzim tertinggi berada
pada pH 5,5 dan 4,0 (tidak berbeda
nyata) dengan nilai aktivitas sebesar
(65,16 dan 59,83) U/L. Menurut
Barizi et al., (2020) hal ini
membuktikan bahwa ada nya dua
enzim yang berbeda yang terdapat
pada T. asperellum. Dua gen enzim
ini dapat berkativitas dengan baik
pada dua pH dari hasil uji yang telah
dilakukan. Terjadi penurunan
aktivitas pada pH 6 dan 6,5 dan pada
pH 7,0 -8,0 enzim sudah tidak
beraktivitas. Menurut Husna et al.
(2017), pH optimum enzim lakase
bekisar antara 3,0 – 7,0.
Peningkatan aktivitas dari pH 4,0
dan mengalami penurunan pada pH
4,5. Hingga mencapai pH optmum
pada pH 5,5 dan terus menurun
seiring peningkatan nilai pH buffer.
Penurunan pH yang terjadi pada
pH 6,0-8,0 disebabkan karena
meningkatnya konsentrasi [OH-]
yang menyebabkan aktivator yang
dapat mempengaruhi aktivitas
katalitik sisi aktif enzim. Perubahan
pH berpengaruh terhadap perubahan
ionisasi rantai samping asam amino
5
 Gambar 1. Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas enzim lakase

Tabel 1. Pengaruh variasi pH terhadap aktivitas enzim lakase

pada sisi aktif, yang berperan dalam amino melepaskan H+ sehingga

menjaga konformasi sisi aktif enzim menjadi muatan netral, sedangkan
dalam mengikat substrat dan gugus karboksil bermuatan negatif
mengubah substrat menjadi produk (Husna et al., 2017).
(Nelson, 2008).
Kondisi keasaman (pH) b. Pengaruh suhu terhadap
berpengaruh terhadap asam amino aktivitas enzim lakase
penyusun protein enzim. Gugus Pada penentuan pengaruh suhu
karboksil pada asam amino terhadap aktivitas enzim lakase
cenderung mengikat ion H pada +
dilakukan pada suhu 30-60oC dengan
suasana asam. Hal ini interval 5oC pada pH 5,5. Masing-
mengakibatkan gugus karboksil masing suhu yeng telah dilakukan uji
bersifat netral, sedangkan gugus menunjukkan aktivitas yang berbeda,
amino bermuatan positif. Enzim dapat dilihat pada Gambar 2. dan
pada suasan basa membuat gugus Tabel 2.

6
 Gambar 2. Pengaruh variasi suhu terhadap aktivitas enzim lakase

Tabel 2. Pengaruh variasi suhu terhadap aktivitas enzim lakase

Hasil dari penelitian yang telah dan enzim. Tumbukan yang sering
dilakukan pada pengaruh variasi terjadi akan mempermudah
temperatur terhadap aktivitas enzim pembentukan kompleks enzim-
lakase T. Asperellum LBKURCC1 substrat, sehingga produk yang
menunjukkan bahwa, aktivitas terbentuk semakin banyak
enzim mengalami kenaikan pada (Kusumaningrum et al., 2019).
suhu 45oC dengan nilai aktivitas Tetapi ketika suhu ditingkatkan
sebesar 242,66 U/L. Kenaikan hingga 60oC aktivitas enzim lakase
temperatur menyebabkan aktivitas menurun, peningkatan suhu secara
enzim meningkat, karena umum akan meningkatkan
temperatur yang semakin tinggi kecepatan reaksi kimia enzim, tetapi
akan meningkatkan energi kinetik kenaikan suhu yang terlalu tinggi
yang mempercepat gerak vibrasi, melebihi suhu optimum kerja
translasi dan rotasi enzim dan enzim akan menyebabkan
substrat, sehingga menambah terjadinya denaturasi enzim yaitu
intensitas tumbukan antara substrat berubahnya struktur protein enzim,

7
sehingga menyebabkan terjadinya
penurunan kecepatan reaksi yang
dikatalisis enzim tersebut
(Kusumaningrum et al., 2019).
Pada penelitian ini aktivitas
enzim lakase tertinggi diperoleh pada
suhu 45oC yang berbeda secara
signifikan dengan variasi suhu
lainnya. Menurut Firliani et al.,
(2015) enzim yang mampu
beraktivitas pada suhu 45-88oC
tergolong enzim termofiik. Enzim
termofilik mengandung protein tahan
panas dan tahan denaturasi sehingga
mampu beradaptasi dengan kondisi
lingkungan yang bersuhu ekstrim.
Enzim termofilik biasanya dapat
digunakan dalam dunia industri.
KESIMPULAN
Aktivitas tertinggi enzim lakase pada
uji variasi pH diperoleh pada pH 5,5
dan 4,0 yang tidak berbeda nyata
berdasarkan uji Duncan jarak
bergenda (Duncan’s Multiple Range
Test) pada taraf 5% (p¿ 0,05) dengan
nilai sebesar (65,16 ± 14,28) dan
(59,83 ± 5,25) U/L. Aktivitas
tertinggi enzim lakase pada uji
variasi suhu diperoleh pada
temperatur 45 C dengan nilai
o
aktivitas sebesar 224,66 ± 17,39 U/L
DAFTAR PUSTAKA
Baldrian P., Wiesche, C., Gabriel, J.,
Nerud, F., & Zadrazil F.
2000. Influence of cadmium
and mercury on activities of
ligninolytic enzymes and
degradation of polycyclic
aromatic hydrocarbons by
Pleurotus ostreatus in soil.
Appl Environ Microbiol. 66:
2471- 2478.
Barizi, A., Iti'anah, D., dan Utami, U.
2020. Karakterisasi enzim
amilase dari bakteri bacillus
megaterium pada variasi
suhu, pH dan konsentrasi
substrat. Jurnal Riset Biologi
dan Aplikasinya. 2(1): 11-17.
Durand, A., Chase, Z., Remenyi, T.,
& Queroue, F. 2012.
Microplate-reader method for
the rapid analysis of copper in
natural waters with
chemiluminescence detection.
Frontiers in Microbiology.
3(1): 437.
Gustina, Helianty, S., & Dahliaty, A.
2018. Produksi Enzim Lakase
Oleh Jamur Trichoderma
asperellum LBKURCC1
Dalam Bioreactor Tray
Menggunakan Variasi
Ukuran Substrat Jerami Padi
Dan Induser CuSO4 Pada
Fermentasi Kultur Padat. Jom
FTEKNIK. 5(2): 1.
Husna, N. R., Hasri., & Sudding.
2017. Pengaruh ph terhadap
degradasi pewarnadirect blue
menggunakan jamur pelapuk
kayu (pleurotus flabellatus).
Jurnal Kimia Riset. 2(2): 140-
146
Igem, U. 2019. proof of concept
protocol upsala igem.
Availablefrom:https://static.ig
em.org/mediwiki/2019/d/d7T
Uppsala_Universitetenzymep
rotocols.pdf. Accesed 24
march 2019.
Iwara, B. S., Helianty, S., Dahliaty,
A., Program, M., Kimia, S. T.
2021. Produksi enzim lakase
oleh jamur Trichoderma
8
 asperelloides LBKURCC2 secara fermentasi padat
menggunakan substrat jerami batang padi dalam reaktor
padi secara fermentasi kultur labu. 1(8): 7-16.
padat dengan variasi waktu Firliani, W., Agustin, A., dan Febria,
fermentasi dan laju aerasi 1,5 F. A. 2015. Karakteriasi
L/M 1). Jom FTEKNIK. 8(1): bakteri termofilik penghasil
1-6. enzim protase netral. Jurnal
Kusumaningrum, A., Gunan, I. bagus Biologi Universitas Andalas.
wayan, & Wijaya, M. 4(1): 9-14.
mahaputra. 2019. Optimasi Santoso, K., Herowati, U. K.,
suhu dan ph terhadap Rotinsulu, D. A., Murtini, S.,
aktivitas enzim Ridwan, M. Y., Hikman, D.
endoglukanase menggunakan W., Zahid, A., Wicaksono,
response surface A., Nugraha, A. B., Afiff, U.,
methodology ( RSM ). Jurnal Wijaya, A., Arif, R., Tarigan,
Rekayasa Dan Manajemen R., & Sukmawinata, E. 2021.
Agroindustri. 7(2): 243–253. Comparison of colorimetric-
Nadyani, K. 2022. Optimasi pH dan based rabies postvaccination
Suhu Pada Reaksi Enzimatis antibody titer detection using
Lakase Trichoderma elisa reader and mobile phone
asperellum LBKURCC1 camera. Jurnal Veteriner.
Hasil Fraksinasi 20-80 22(1): 79–85.
Ammonium Sulfat. Skripsi. Sudarson, J., Ramalingam, S.,
Pekanbaru: Universitas Riau. Kishorekumar, P., &
Nelson, D. L., dan Cox, M. M. 2008. Venkatesan, K. 2014.
Lehninger Principles of Expeditious Quantification of
Biochemistry. W. H. Lignocellulolytic Enzymes
Freeman. from Indigenous Wood Rot
and Litter Degrading Fungi
Nugroho, T. T., Sellyna, N., Miranti.,
from Tropical Dry Evergreen
Nurulita, Y., Saputra, E., dan
Forests of Tamil Nadu.
Utama, P. S. 2020.
Biotechnology Research
Optimasilisasi waktu
International.
fermentasi, kadar air dan
konsentrasi Cu2+ pada
produksi lakase Trichoderma
asperellum LBKURCC1