Lipase

I.

Tujuan Menentukan aktivitas enzim lipase pada reaksi hidrolisis triasilgliserol dengan

metode kurva perubahan pH terhadap waktu.

II.

Teori Dasar Enzim adalah suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam proses

aktivitas biologis. Enzim berfungsi katalisator (biokatalis) dan sifatnya sangat khas. Reaksi enzimatis mempunyai beberapa kelebihan yaitu reaksi yang terjadi berlangsung pada suhu kamar dan pH mendekati netral, energi aktivasi reaksi rendah, tingkat konversi tinggi, polutan yang dihasilkan sedikit dan reaksi bersifat spesifik (Judoamidjojo, 1989). Pada mulanya enzim dianggap hanya terdiri dari protein dan memang ada enzim yang ternyata hanya tersusun dari protein saja, misalnya pepsin dan tripsin. Namun, ada juga enzim-enzim yang selain protein juga memerlukan komponen selain protein. Komponen selain protein pada enzim dinamakan kofaktor. Kofaktor merupakan ion logam/ metal, atau molekul organik yang dinamakan koenzim. Gabungan antara bagian protein enzim (apoenzim) dan kofaktor dinamakan holoenzim. Enzim yang memerlukan ion logam sebagai kofaktornya dinamakan metaloenzim. Ion logam ini berfungsi untuk menjadi pusat katalis primer, menjadi tempat untuk mengikat substrat, dan sebagai stabilisator supaya enzim tetap aktif. Walaupun katalisator ikut serta dalam reaksi, ia kembali ke keadaan semula bila reaksi telah selesai. Hampir semua enzim merupakan protein. Pada reaksi yang dikatalisasis oleh enzim, molekul awal reaksi disebut sebagai substrat, dan enzim mengubah molekul tersebut menjadi molekul-molekul yang berbeda, disebut produk. Hampir semua proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat berlangsung dengan cukup cepat. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi dan dengan demikian mempercepat proses reaksi. Percepatan terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap.
Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik 1

Enzim yang bekerja dalam hidrolisis lemak dan minyak dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok besar yaitu lipase dan esterase. Perbedaan lipase dan esterase yaitu pada status larutan substrat. Lipase aktif dalam emulsi minyak dalam air, sedangkan esterase aktif pada larutan dan emulsi (Winarno, 1995).

III.

Cara Kerja III.1 Ekstraksi Crude Lipase Sebanyak 20 g kacang digerus lalu ditambahkan 5 mL air dan digerus kembali (diulang hingga penambahan 100 mL air). Hasil penggerusan berupa pasta halus disentrifugasi pada 300 rpm selama 20 menit (terbentuk 3 lapisan). Lapisan atas (cream) dipipet dan ditempatkan dalam flask tertutup. Lapisan air (tengah) dibuang, lalu residu diekstrak kembali dengan 100 mL air. Pasta halus yang terbentuk disentrifugasi lagi selama 20 menit pada 300 rpm. Lapisan teratas dipipet dan dicampurkan dengan fraksi sebelumnya. Fraksi diberi label ekstrak enzim kasar dan disimpan di dalam lemari es. III.2 Aktivitas Lipase Sebanyak 40 mL emulsi minyak olive dalam air dibuat dengan cara menuangkan ke corong pemisah 20 mL. Ke dalam corong ditambahkan 18 mL air, 2 mL NaOH 0,1 M, dan 0,5 mL asam oleat lalu dikocok kuat-kuat (emulsi terbentuk dalam 1 menit). pHmeter distandarkan terhadap larutan buffer standar pH 7. Elektroda di dalam emulsi diteteskan asam encer sambil diaduk hingga pH 7,0. Sebanyak 10 mL emulsi dipipet ke dalam gelas kimia 50 mL. Elektroda diletakkan di dalam substrat emulsi dan diberi air hingga ujung elektroda tepat terendam. Campuran diaduk dengan pengaduk magnetik dan ditambahkan 2 mL suspensi enzim (pH dicatat tiap 2 menit selama 30 menit). Percobaan diulang dengan suspense enzim yang telah didihkan.

IV.

Data Pengamatan Tabel IV.1 Data Perubahan pH terhadap Waktu Waktu pH tanpa pemanasan pH dengan pemanasan
2

Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik

0 2 4 6 8 10 12 14

6,71 6,67 6,64 6,37 6,15 6,11 6,14 5,73

6,8 6,76 6,76 6,75 6,75 6,75 6,75 6,75

V.

Pengolahan Data Grafik V.1 Kurva Perubahan pH terhadap Waktu

Kurva Perubahan pH terhadap Waktu

7 6.8 6.6 6.4 6.2 6 5.8 5.6 0 5 10 Waktu (menit) 15 tanpa pemanasan dengan pemanasan Linear (tanpa pemanasan) Linear (dengan pemanasan)

VI.

Pembahasan Pada percobaan ini dilakukan penentuan aktivitas enzim lipase berdasarkan

perubahan pH terhadap waktu. Pada percobaan ini, enzim lipase berfungsi untuk mengkatalisis terjadinya reaksi hidrolisis dan sintesis triasilgliserol dan asam lemak rantai panjang. Enzim ini bekerja secara spesifik untuk substrat yang memiliki gugus ester. Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran yaitu lipase akan memecah triasilglierol agar bisa melewati membran dalam mitokondria untuk dioksidasi lebih lanjut. Namun, enzim ini sedikit sulit untuk diekstraksi dan tidak bekerja pada pH rendah.

Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik

pH

Struktur lipase pankreas sangat cocok untuk melaksanakan fungsi katalitik. Proteinnya terdiri dari dua domain. Domain N-terminal, asam amino 1-336, adalah ukuran butir dari kedua -heliks dan -sheet. Domain C-terminal sebagian besar -sheet dan mengandung residu 337-449. Enzim terlihat berbentuk seperti keranjang dengan sisi yang dibentuk oleh residu hidrofobik dari setiap domain untuk menarik lipid nonpolar. Di dasar sisi hidrofobik yang terbentuk antara dua domain merupakan situs aktif. Kemampuan lipase pankreas untuk menghidrolisis ikatan ester disebabkan tiga residu situs aktif yang disebut tiga serangkai katalitik yaitu Ser153, His264, dan Asp177 (Merolla).

Gambar VI.1 Struktur tersier enzim lipase pankreas (Sumber:http://maptest.rutgers.edu/drupal/?q=node/19) Mekanisme katalitik enzim lipase terjadi ketika triasilgliserol (biru) molekul mencapai situs aktif di bagian bawah sisi hidrofobik, mengalami kontak dengan triad katalitik (hijau) yang memicu reaksi hidrolisis, residu Ser152, His263, dan Asp176. Triad ini berorientasi sedemikian rupa sehingga salah satu oksigen terminal pada Asp176 adalah hidrogen terikat dengan nitrogen di ring histidine (ditunjukkan oleh garis putus-putus hitam). Hal ini membuat His263 dalam posisi untuk nitrogen lainnya aromatik untuk membentuk ikatan hidrogen dengan gugus hidroksil dari Ser152. Obligasi ini menarik hidrogen relatif jauh dari oksigen kovalennya. Hal ini menunjukkan enzim aktif (Merolla). Tahap pertama dari reaksi yaitu terjadi serangan nukleofilik dari karbon gliserol pertama oleh rantai samping Ser152. Oksigen yang terlibat dalam ikatan ester sebagai leaving group dan diprotonasi oleh hidrogen Ser152 dari gugus hidroksil untuk menetralkan
Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik 4

muatan negatif. Dengan penambahan ion hidrogen pada oksigen, produk asam lemak pertama terbentuk dan bebas. Gugus gliserol tetap terikat pada oksigen Ser152 dan harus dihilangkan agar enzim tetap berfungsi (Merolla). Berikut gambar mekanisme reaksi tahap 1:

Gambar VI.2 Mekanisme reaksi tahap 1 (Sumber:http://maptest.rutgers.edu/drupal/?q=node/19) Tahap 2 dari mekanisme hidrolisis melibatkan pembentukan dan penghapusan digliserida dari gugus gliserol. Untuk membentuk molekul gliserol, gugus hidroksil diperlukan untuk mengikat karbon pertama dan ion hidrogen yang diperlukan untuk reprotonasi oksigen Ser152. Melalui interaksi ikatan hidrogen dari molekul air ditarik ke dalam bentuk yang dipisahkan. Ion hidronium memiliki momen dipol yang sangat besar dan bertindak sebagai nukleofil pada karbon pertama, sedangkan oksigen Ser152 adalah leaving group. Rantai samping bermuatan negatif dari Ser152 dengan cepat diprotonasi oleh ion hidrogen yang berasal dari air. Produk digliserida lainnya kini terbentuk. Ikatan hidrogen antara nitrogen aromatik dari His263 dan kelompok hidroksil pada Ser152 reformasi dengan
Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik 5

hidrogen baru dan enzim dalam orientasi aslinya siap untuk digunakan pada reaksi yang lain (Merolla). Gambar mekanisme tahap 2 sebagai berikut:

Gambar VI.3 Mekanisme reaksi tahap 2 (Sumber: http://maptest.rutgers.edu/drupal/?q=node/19) Reaksi hidrolisis selanjutnya terjadi untuk mengkatalisis digliserida baru yang terbentuk menjadi asam lemak dan monogliserida. Mekanismenya sama dua langkah sebelumnya, kecuali serangan nukleofilik dilakukan pada karbon ketiga dari gliserol, dan molekul air lain yang digunakan. Setelah mekanisme ini, monogliserida terikat dan dihasilkan asam lemak baru dari situs aktif, dan enzim digunakan untuk trigliserida berikutnya. Jenis jenis enzim lipase yang dikenal ada 4, yaitu: 1. Lipase Pankreas Pada manusia, lipase pankreas disekresikan oleh pankreas bersama dengan garam-garam empedu dan disimpan dalam kantong empedu, kemudian dilepaskan ketika kim (makanan tercerna) memasuki usus kecil. Garam empedu berfungsi sebagai pengemulsi lemak menjadi molekul yang lebih
Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik 6

kecil sehingga memperluas area permukaan dan meningkatkan efektivitas lipase dalam mengkatalisis pencernaan lemak. 2. Lipase Intraseluler Lipase juga berperan dalam intraseluler pada lisosom, organel yang membantu menghilangkan produk sampah dari sel. Belum ada consensus yang jelas mengenai peran spesifik lipase dalam lisosom selain memecah lipoprotein dalam sel. Namun, peneliti dari Albert Einstein College of Medicine menunjukkan bahwa lipas juga bisa berfungsi dalam pengaturan penyimpanan lipid intraseluler. 3. Lipase pada Bakteri Banyak spesies jamur dan bakteri yang mensekresi lipase untuk membantu penyerapan nutrisi dari lingkungan. Hal ini dibuktikan pada produksi keju dan yogurt dari bakteri yang memanfaatkan lipase sebagai sarana memecah lemak susu. Berbagai penelitian saat ini sedang menguji produksi biofuel dari minyak tumbuhan menggunakan lipase dari bakteri untuk memfasilitasi pemecahan minyak. 4. Fosfolipase Berbagai macam serangga dan ular menggunakan lipase jenis tertentu yang disebut fosfolipase untuk meningkatkan daya racun sengatan atau gigitan. Pada tahap preparasi, sampel ditambahkan asam oleat yang berfungsi sebagai emulgator karena asam lemak ini memiliki gugus hidrofil dan gugus hidrofob. Gugus hidrofil dari asam oleat akan berikatan dengan enzim lipase (polar), sedangkan gugus hidrofobnya berikatan dengan asam lemak (nonpolar). Buffer pH 4 dan 7 digunakan untuk kalibrasi pHmeter. Buffer pH 7,0 juga digunakan untuk mempertahankan pH sampel pada 7,0 karena kerja optimum enzim lipase pada pH tersebut dan agar enzim tidak terdenaturasi. Fungsi NaOH ialah , sedangkan HCl berfungsi sebagai . Metode yang digunakan pada percobaan ini ialah metode perubahan pH terhadap waktu. Metode ini tidak memberikan akurasi yang baik, hal ini bisa dilihat dari nilai pH yang tidak mengalami penurunan secara bertahap atau fluktuatif. Hal ini bisa dikarenakan oleh kondisi elektroda yang kurang peka membaca nilai pH dan kalibrasinya kurang baik, kondisi larutan dan juga perlakuan yang tidak ideal pada sampel yang akan dianalisis juga turur
Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik 7

berpengaruh. Metode ini mengukur langsung jumlah asam lemak yang dihasilkan ke dalam larutan lewat perubahan pH. Jika lipase masih memproduksi asam lemak maka larutan akan segera bertambah asam yang ditunjukkan oleh penurunan nilai pH tiap waktu 2 menit pengukuran. Ketika pH larutan menunjukan nilai konstan pada pH yang makin asam maka aktifitas lipase dalam memproduksi asam lemak telah berhenti. Pada percobaan dianalisis aktivitas enzim lipase dalam 2 kondisi pengukuran yang berbeda yaitu menggunakan enzim lipase tanpa pemanasan dan enzim lipase dengan pemanasan. Hasil kurva pH terhadap waktu menunjukkan bahwa enzim lipase yang tidak dipanaskan memiliki kinerja katalitik yang lebih baik daripada enzim lipase yang dipanaskan. Hal ini dikarenakan enzim lipase yang dipanaskan sebagian besar telah terdenaturasi sehingga kehilangan fungsi katalitiknya. Dari kurva enzim lipase yang dipanaskan tetap ada penurunan pH yang menunjukkan masih ada sedikit enzim yang tersisa dan menghasilkan asam lemak namun penurunan pHnya tidak signifikan. Hasil analisis menunjukkan bahwa kerja enzim lipase sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan seperti pH, suhu, gangguan mekanik, dan penambahan garam.

VII.

Simpulan Berdasarkan hasil percobaan dan pengolahan data, saya menyimpulkan bahwa

aktivitas enzim lipase cukup baik pada kondisi tanpa pemanasan dan dilakukan pada pH dan suhu optimumnya..

VIII. Daftar Pustaka Judoamidjojo, M. E. (1989). Biokonversi Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB. Bogor. halaman: 563-567. Merolla, M. F. (n.d.). Molecular Anatomy Project. Accessed March 3, 2013, from http://maptest.rutgers.edu/drupal/?q=node/19 Winarno, F. (1995). Enzim Pangan. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. halaman: 85-90.

Laboratorium Biokimia ITB | Laporan Praktikum Metabolisme dan Informasi Genetik