Praktikum Purifikasi Bioproduk 2022

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS α-AMILASE DARI USUS DAN ISI TUBUH
LARVA BLACK SOLDIER FLY
Rena Pitri Amelia & 200105012
Program Studi Bioteknologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Muhammdiyah Bandung
Jl. Soekarno Hatta No. 752, Cipadung Kidul, Panyileukan, Kota Bandung
Email: renaameliabusiness@gmail.com

I. PENDAHULUAN Dalam produksi enzim amilase, utamanya

bakteri yang digunakan berasal dari genus
Enzim amilase merupakan salah satu jenis
Bacillus karena dapat memproduksi enzim
enzim yang banyak diaplikasikan dalam
yang bersifat thermostable atau tahan pada
bidang industri. Pada industri tekstil, enzim
suhu tinggi. Namun terdapat permasalahan
amilase digunakan untuk menghilangkan
yang dihadapi, yaitu terdapat kebutuhan
pati saat penenunan. Pada industri pangan,
nitrogen sebagai nutrisi yang biayanya
amilase dapat menghidrolisis pati menjadi
1,4
tinggi .
gula, proses ini diaplikasikan pada
pembuatan sirup glukosa. Pada industri Black soldier fly (BSF) merupakan salah
bioetanol, fermentasi mikroorganisme satu organisme yang dapat mendegradasi
penghasil etanol dari bahan dasar gula bahan organik secara ekonomis dengan
didapat dari proses hidrolisis pati dengan nutrisi minimal secara cepat karena memiliki
amilase¹. Amilase terdiri dari tiga jenis, mikroba dengan keragaman yang tinggi⁵.
salah satunya adalah α-amilase². Enzim α- Mikroba dalam usus larva yang
amilase berada di dalam ludah (saliva) dan pencernaannya berhabitat amilolitik dapat
pankreas. Enzim α-amilase (α-1,4-glukan-4- membantu BSF mengonversi limbah organik
glukanohidrolase, EC. 3.2.1.1) mengkatalisis menjadi lemak dan protein menjadi
pemecahan ikatan 1-4 yang terdapat dalam 6, 7
biomassa . Beberapa penelitian
amilum³. Enzim ini disebut dengan menemukan adanya potensi amilase, lipase,
endoamilase karena memecah bagian dalam dan protease dari ekstrak usus larva BSF dan
atau tengah molekul amilum². fungsi B. subitilis yang dapat memproduksi
amilase⁸.

Modul Isolasi Protein

 Praktikum Purifikasi Bioproduk 2022

Untuk dapat mengasilkan dan menguji Bahan-bahan yang digunakan dalam

ekstrak kasar dari usus larva BSF, dilakukan
isolasi protein dengan metode Fuwa. Isolasi
protein dilakukan berdasarkan prinsipnya,
yaitu melakukan pencucian jaringan dan
metode lisis (peristiwa pecah atau rusaknya
integritas membran sel dan menyebabkan
keluarnya organel sel) sesuai jenis sel dan
jaringannya. Pengujian ekstrak kasar
dilakukan dengan metode Fuwa berdasarkan
prinsipnya. Yaitu hidrolisis ikatan α(1-4)
pada substrat (amilum) oleh α-amilase pada
sampel menjadi gulasederhana. Substrat
yang tersisa dengan kehadiran iodin akan
membentuk larutan kompleks berwarna,
dapat diamati dengan spektrofotometer
(A560)⁹.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan
isolasi protein (ekstrak kasar) dari usus perut
larva BSF dan menguji keberadaan enzim
pada ekstrak kasar dengan metode Fuwa.
II. METODE
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian
ini adalah alat bedah yang terdiri dari
gunting dan pinset, cawan petri, ice bath,
waterbath, instrumen spektrofotometer,
kuvet, vorteks, dan sentrifuga.
Bahan
penelitian ini adalah larva H. illucens dari
sentra larva BSF dari Kelurahan Padasuka
Kota Cimahi sebanyak 50 ekor, buffer fosfat
1× × pH 7,4, akuades, kasein 0,1%, Tri
Chloro Acetic Acid (TCA) 10%, pati 0,1%,
asam klorida 1 N, dan kalium iodide (KI-I 2)
0,2% dalam 2% KI.
III. LANGKAH KERJA
Ekstraksi α-Amilase dari Larva BSF
Sebanyak 50 ekor larva BSF dibedah pada
bagian dorsal dengan dengan membuat
sayatan membujur dari kelapa hingga anus.
Alat, bahan, dan kondisi perlakuan
dilakukan dalam keadaan dingin di atas ice
bath. Usus dan isi tubuhnya dipisahkan dan
disimpan ke dalam pelarut buffer fosfat
(PBS) pH 7,4 pada suhu 4°C. Usus dan isi
tubuh larva divorteks selama 1 menit agar
lisis. Homogenat disentrifugasi dengan
kecepatan 14.000 × g selama 5 menit.
Supernatan usus dan isi tubuh larva
dipisahkan sebagai ekstrak kasar (crude
extract)¹⁰.
Uji Aktivitas α-Amilase dari Ekstrak
Kasar
Aktivitas ekstrak kasar usus dan isi tubuh
larva BSF diuji menggunakan metode Fuwa.
Larutan 0,1% pati dibuat dengan dilarutkan

Modul Isolasi Protein

 Praktikum Purifikasi Bioproduk 2022

pada akuades dan dipanaskan hingga pati Proses ekstrasi diperlukan dalam kondisi
terlarut. Sebanyak 100 μL larutan 0,1% pati dingin agar dapat menjaga enzim untuk
terlarut ditambahkan sampel enzim berupa tidak terdenaturasi 11, 12.
ekstrak kasar usus dan isi tubuh
Campuran usus atau isi tubuh larva BSF dan
ditambahkan sebanyak 100 μL. Campuran
reagen divorteks selama 1 menit agar terjadi
sampel dan pati diinkubasi pada suhu 50°C
proses lisis yang menyebabkan membran sel
selama 10 menit. Sebanyak 100 μL 1 N
larva pecah dan organel sel keluar.
larutan asam klorida (HCl) ditambahkan.
Campuran disentrifugasi dengan kecepatan
Sebanyak 100 μL larutan kalium iodida (KI-
14.000 × g selama 5 menit, hingga terpisah
I 2) 0,2% I 2 dalam 2% KI. Campuran
antara pelet dan supernatan. Prinsip utama
diencerkan dengan akuades hingga volume 2
dari sentrifugasi adalah sendimentasi, di
mL. Absorbansi diukur pada panjang
mana untuk memisahkan substansi
gelombang (λ) 600 nm. Aktivitas enzim
berdasarkan kepadatannya (besar dan kecil)
dihitung dengan menggunakan persamaan di
bekerja berdasarkan percepatan
bawah ini.
sentripetalnya. Sehingga substansi yang
Abs. blanko × Abs. sampel lebih ringan akan berada di atas dan
Aktivitas = × FP
Abs. blanko
substansi yang lebih berat akan berada di
1 u
× = bawah¹³. Hasil dari sentrifugasi terdiri dari
Vol. enzim mL
ekstrak kasar (supernatan) dan organel-
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN organel sel yang mengendap di bagian

Ekstraksi α-Amilase dari Larva BSF bawah (pelet). Supernatan yang diperoleh
selanjutnya disebut sebagai ekstrak kasar
Larutan buffer fosfat dengan nilai pH 7,4
(crude extract) karena protein larut dengan
yang digunakan dalam proses ekstraksi
buffer sehingga berwarna bening.
amilase berfungsi sebagai pengontrol agar
terhindar dari inaktivasi akibat pH yang
berubah. Pemilihan pH 7,4 karena
mendekati netral. Denaturasi akan dialami
enzim jika pelarut yang digunakan bersifat
asam, basa, atau pelarut organik. Denaturasi Gambar 1. Ekstrak kasar isi tubuh (kiri) dan usus
menyebabkan enzim tidak dapat bekerja. (kanan) dari larva BSF.

Modul Isolasi Protein

 Praktikum Purifikasi Bioproduk 2022

Uji Aktivitas α-Amilase dari Ekstrak banyak jumlah enzim α-amilase maka
Kasar semakin banyak amilum yang didegradasi
menjadi molekul gula sederhana (glukosa)
Pati singkong yang ditambahkan dalam
sehingga terjadi perubahan sifat fisik
proses pengujian aktivitas enzim berfungsi
amilum¹⁷.
sebagai substrat. Pati singkong dan enzim
diinkubasi pada suhu panas 50°C agar enzim Campuran ditambah asam klorida (HCl) dan
mencapai suhu optimum sehingga dapat kalium iodida (KI-I2). Penambahan HCl
meningkatkan kecepatan reaksi¹². Pati untuk menghentikan aktivitas enzim.
singkong memiliki amilum yang merupakan Penambahan KI-I2 dapat mendeteksi
karbohidrat. Secara umum amilum terdiri keberadaan karbohidrat karena adanya
dari 20% bagian yang larut air (amilosa) dan menghasilkan kompleks heliks berwarna
80% bagian yang tidak larut air biru antara reagen amilosa dengan amilosa¹².
(amilopektin)¹⁴. Campuran yang di dalamnya terdapat
substrat yang tersisa dari hasil pemotongan
Amilum dapat dimodifikasi dengan cara
enzim α-amilase, akan menghasilkan warna
fisika, kimia, dan hidrolisis. Modifikasi
kuning karena pati telah terhidrolisis oleh α-
secara hidrolisis dilakukan dengan
amilase.
memanfaatkan enzim yang dihasilkan oleh
mikroorganisme dalam proses Hasil penentuan aktivitas α-amilase dari
metabolismenya. Bakteri dengan genus ekstrak kasar dapat dilihat pada Tabel 1.
Bacillus yang ada pada usus larva BSF
Tabel 1. Data hasil penentuan aktivitas
mampu memproduksi α-amilase yang
α-amilase.
mampu mendegradasi amilum dengan
Sampel Unit Aktivitas (U/mL)
memotong ikatan α-(1-4)-glikosidik pada
Blanko -
amilosa dan amilopektin. Di antara amilum
Usus 704
yang berasal dari umbi-umbian, amilum
Isi tubuh 422
singkong merupakan amilum yang paling
mudah dihidrolisis oleh enzim α-amilase 15, 16
. Berdasarkan Tabel 1., blanko sebagai
kontrol negatif tidak menghasilkan aktivitas
Perubahan sifat fisik amilum dipengaruhi spesifik karena hanya berisi akuades dan
oleh jumlah enzim α-amilase, semakin

Modul Isolasi Protein

 Praktikum Purifikasi Bioproduk 2022

pati. Aktivitas spesifik α-amilase pada dengan penelitian-penelitian sebelumnya.

ekstrak usus larva BSF lebih besar Hal ini disebabkan oleh pati yang digunakan
dibandingkan dengan aktivitas spesifik α- tidak murni amilum dan tidak dididihkan
amilase pada ekstrak isi tubuh larva BSF. terlebih dahulu sehingga masih mengandung
Hal ini disebabkan jumlah amilase yang karbohidrat jenis lain.
terisolasi pada ekstrak usus lebih banyak
daripada daripada ekstrak isi tubuh, V. KESIMPULAN
sehingga aktivitas spesifiknya lebih besar.
Protein (ekstrak kasar) dari usus larva BSF
Ekstrak usus lebih banyak mengandung
diperoleh dari proses isolasi dan enzim diuji
enzim amilase karena di dalamnya terdapat
keberadaan dan aktivitasnya dengan metode
habitat bakteri amilolitik, yaitu bakteri genus
Fuwa. Diperoleh ekstrak kasar dengan
4
Bacillus . Namun, nilai aktivitas spesifik
aktivitas 704 u/mL dari usus larva BSF dan
pada penelitian ini lebih besar dibandingkan
422 u/mL dari isi tubuh larva BSF.

VI. DAFTAR PUSTAKA

1. Souza PMD. Application of microbial α -amylase in industry-A review. Brazilian journal of
microbiology. 2010;41(4): 850-861.
2. Poedjiadi A, Supriyanti T. Dasar-dasar biokimia. Jakarta, Indonesia: UI-Press; 2006.
3. Ariandi M. Pengenalan enzim amilase (alpha-amylase) dan reaksi enzimatisnya menghidrolisis
amilosa pati menjadi glukosa. Jurnal Dinamika. 2016;7(1): 74-82.
4. Vidyalakshmi R, Paranthama R, Indhumathi J. Amylase production on submerged fermentation by
Bacillus spp. World Journal of ChemistrY. 2009; 4(1), 89-91.
5. Ng SM, Tey LH, Leong SY, Ng SA. Isolation, screening and characterization of the potential
microbes to enhance the conversion of food-wastes to bio-fertilizer. In AIP Conference Proceedings.
2019;2157(1): 020048.
6. Zheng L, Li Q, Zhang J, Yu, Z. Double the biodiesel yield: rearing black soldier fly larvae, hermetia
illucens, on solid residual fraction of resteurant waste after grease extraction for biodiesel
production. Renewable Energy. 2011;41: 75-79.
7. Supriyatna A, Ukit U. Screening and isolation of cellulolytic bacteria from gut of black soldier flays
larvae (Hermetia illucens) feeding with rice straw. Biosaintifika: J of Biology and Biology
Education. 2016;8(3): 314-320.

Modul Isolasi Protein

 Praktikum Purifikasi Bioproduk 2022

8. Kim W, Bae S, Park K, Lee S, Choi Y, Han S, Koh Y. Entomology biochemical characterization of
digestive enzymes in the black soldier fly, Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae). J of Asia-
Pacific Entomology. 2011;14 (1): 11–14.
9. Muharram LH. Modul praktikum purifikasi bioproduk. Universitas Muhammadiyah Bandung:
Program Studi Bioteknologi; 2022.
10. Bollag DM, Rozycki MD, Edelstein SJ. Protein methode. New York: Wiley-Liss; 1996.
11. Rahayu A. Ekstraksi enzim tyrosinase dari apel malang (Malus domestica). 2015.
12. Rani G, Paresh G, Harapriya M, Vineet KG, and Bhavna C. Microbial α-amylases: a
biotechnological perspective. Process Biochemistry. 2003; 1-18.
13. Hawa LC, Lastriyanto A, Ervantri AA. Analisis sifat fisik dan kandungan gizi produk krim susu
menggunakan teknologi sentrifugasi. Jurnal Ilmiah Rekayasa Pertanian dan Biosistem. 2019;7(2):
196-206.
14. Gunawan D, Mulyani S. Ilmu obat alam (farmakognosi). Jilid 1. Jakarta: Penebar Swadaya; 2004.
15. Sadeghi A, Shahidi F, Mortazavi AS, Mahalati MN. Evaluation of different parameters effect on
maltodextrin production by a-amylase termamyl 120L. World Appl. Sci. Journal. 2008;3(1); 34-39.
16. Rocha, ÓDS, Carneiro APDA, Franco, CML. Effect of enzymatic hydrolysis on some
physicochemical properties of root and tuber granular starches. Ciênc. Tecnol. Aliment. Campinas.
2010;30(2): 544-551.
17. Sujka M, Jamroz J. a-Amylolysis of native potato and corn starches – SEM, AFM, nitrogen and
iodine sorption investigations. LWT - Food Sci. Technol. Int. 2009;42(2009): 1219–122.

Lampiran 1. Perhitungan Aktivitas α-Amilase dari Usus dan Isi Tubuh Larva BSF

Diketahui:

Absorbansi blanko = -0,016

Absorbansi ekstrak kasar usus larva = 0,688

Modul Isolasi Protein

 Praktikum Purifikasi Bioproduk 2022

Absorbansi ekstrak kasar isi tubuh = 0,406

Faktor Pengenceran = 1,6

Volume Enzim = 0,1

1. Aktivitas α-Amilase dari Usus Larva BSF

Abs. blanko - Abs. sampel

Aktivitas Enzim = × Faktor Pengenceran ×
Abs. blanko
1 u
=
Vol. enzim (mL) mL
-0,016 -0,688 1
= × 1,6 ×
-0,016 0,1
-0,704 1
= × 1,6 ×
-0,016 0,1
1
= 44 × 1,6 ×
0,1
70,4
=
0,1
= 704 u/mL

2. Aktivitas α-Amilase dari Isi Tubuh Larva BSF

Abs. blanko - Abs. sampel

Aktivitas Enzim = × Faktor Pengenceran ×
Abs. blanko
1 u
=
Vol. enzim (mL) mL
-0,016 - 0,406 1
= × 1,6 ×
-0,016 0,1
-0,422 1
= × 1,6 ×
-0,016 0,1
1
= 26,375 × 1,6 ×
0,1
42,2
=
0,1
= 422 u/mL

Modul Isolasi Protein