8
Ekstrak air daun wungu dapat
mengekstrak senyawa flavonoid dan alkaloid,
tetapi tanin, saponin, dan steroid menunjukkan
hasil yang negatif. Ekstrak alkohol 30%
mampu mengekstrak senyawa alkaloid,
flavonoid, dan saponin, sedangkan tanin dan
steroid menunjukkan hasil negatif. Ekstrak
etanol 70% mampu mengekstraksi semua
senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, saponin,
dan steroid. Ekstrak etanol 96% mampu
mengekstraksi senyawa alkaloid, flavonoid,
tanin, dan steroid sedangkan saponin
menunjukkan hasil negatif. Ekstrak daun
wungu yang digunakan pada penelitian ini
adalah ekstrak etanol 70% karena merupakan
ekstrak terbaik dari hasil pengujian fitokimia
dan daya inhibisi enzim α-glukosidase (Irwan
2011).
Sampel daun wungu yang digunakan pada
penelitian ini sama dengan daun wungu yang
digunakan pada penelitian pendahuluan
sebelumnya yaitu tanaman wungu yang
dibudidayakan di Pusat Studi Biofarmaka
(PSB) Bogor. Efek farmakologis daun ungu
yang telah diketahui antara lain untuk peluruh
kencing, mempercepat pemasakan bisul,
pencahar ringan, dan pelembut kulit
(emolient) dan bagian bunga sering
dimanfaatkan untuk haid yang tidak lancar.
Khasiat lainnya untuk pengobatan wasir dan
sembelit, pendarahan, bengkak (PT Eisai
Indonesia editor 1995) obat sakit telinga, dan
secara tidak lansung dapat mengaktifkan
fungsi jantung, dan mengatasi hipertensi (Adi
2008).
Gambar 4 Tumbuhan wungu
(Graptophyllum pictum (L)
Griff).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini
adalah kandang pemeliharan tikus, timbangan,
neraca analitik, maserator, corong pisah, oven,
mortar, pipet tetes, pipet Mohr, labu
Erlenmeyer, syringe 1 mL dan 3 mL, alat-alat
nekrospi, tissue cassette, gelas piala,
mikrotom, penangas air, kaca objek,
mikroskop cahaya, dan mikroskop
imunofluorescent, homogenaizer ULTRA
TURRAX T25, gelas piala, tabung reaksi,
vorteks, tabung sentrifus klinis, sentrifus
klinis HETTICH UNIVERSAL, dan
spektrofotometer ultra violet visible (uv-vis
thermospectronic-USA model genesys 10).
Hewan coba yang digunakan pada
penelitian ini adalah tikus putih jenis
Sparague-Dawley berjenis kelamin jantan
dengan berat badan sekitar 150-250g, aloksan,
pakan tikus (ransum), dan air. Bahan untuk
pembuatan sediaan histopatologi antara lain
jaringan pankreas tikus, parafin, alkohol
absolut, xylol, pewarna Hematoxylin-Eosin
(HE), buffer neutral formalin (BNF) 10%,
alkohol bertingkat (70%, 80%, 90%, 95%,
100%), litium karbonat, dan akuades.
Bahan untuk pembuatan ekstrak adalah
daun wungu dan etanol 70%. Bahan untuk
pengujian imunohistokimia adalah jaringan
pankreas tikus, paraformaldehid 4%, anti-rat
insulin (anti serum), avidin-biotin-peroksidase
(ABC) kompleks, dan pewarna Mayer’s
hematoxylin. Bahan yang digunakan untuk
analisis lipid peroksida adalah NaCl 0.9%
dingin, KCl 1.15% dingin, sodium dodesil
sulfat (SDS) 8.1%, asam asetat 50%, NaOH 1
M, akuades, asam tiobarbiturat (TBA) 1.0%,
n-butanol, piridin, dan 1,1,3,3-
tetrametoksipropana (TMP) 6 M.
Metode
Ekstraksi Daun Wungu ( Irwan 2011)
Sampel daun wungu yang digunakan
berasal dari kebun budidaya tanaman obat,
Pusat Studi Biofarmaka (PSB) Cikabayan.
Daun wungu yang digunakan adalah daun
wungu yang tua (berumur 3-4 bulan) dan
dipanen 4 daun dari pucuk.
Daun wungu (Graptophyllum pictum (L.)
Griff) dikeringkan dalam oven dengan suhu
40-50°C selama 4 hingga 5 hari (kadar air <
10%). Simplisia daun wungu yang sudah
kering kemudian digiling hingga berukuran
100 mesh dan berbentuk serbuk. Sampel yang
berbentuk serbuk diproses dengan metode
ekstraksi yang mengacu pada Badan

Pengawas Obat dan Makanan atau BPOM
(2005) yaitu maserasi. Maserasi sampel
dilakukan dengan merendam sampel dalam
pelarut dengan perbandingan 1:10, proses ini
dilakukan dalam maserator selama 6 jam dan
sesekali diaduk. Kemudian ekstrak sampel
tersebut didiamkan selama 24 jam, maserat
yang didapat dipisahkan, dilakukan
penggantian pelarut dan dilakukan
pengulangan sebanyak 3 kali. Pelarut yang
digunakan yaitu etanol 70%.
Adaptasi dan Perlakuan (Theresia 2011)
Tikus yang digunakan adalah tikus putih
Sprague-Dawley jantan dengan berat badan
sekitar 150-250 g. Tikus jantan dibagi secara
acak ke dalam 7 kelompok perlakuan dengan
jumlah ulangan 6 ekor per kelompok yaitu
kelompok normal, kontrol negatif, kontrol
positif, dan kelompok dengan dosis ekstrak
daun wungu yang berbeda yaitu 25 mg/kgBB,
50 mg/kgBB, 100 mg/kgBB, 200mg/kgBB.
Tikus diadaptasi terlebih dahulu selama 21
hari agar tikus terbiasa dengan lingkungan
penelitian dan memulihkan kondisi hewan
coba dari stres karena pemindahan dan
transportasi. Adaptasi juga dilakukan untuk
menaikkan bobot badan tikus mencapai bobot
maksimal 250 gram. Ransum yang diberikan
selama masa adaptasi merupakan ransum
standar. Ransum standar dan air diberikan
secara adlibitum, yang berarti tikus-tikus
tersebut diberi keleluasaan makan dan minum
kapan saja. Ransum standar diberikan
sebanyak 25 gram per hari selama masa
adaptasi dan perlakuan. Sisa pakan dan berat
badan tikus ditimbang setiap hari semenjak
masa adaptasi dan perlakuan.
Perlakuan dimulai dengan mengukur
konsentrasi glukosa darah tikus pada hari ke-0
untuk melihat keseragaman konsentrasi glukosa
darah hewan coba. Kelompok 4, 5, 6, dan 7
adalah kelompok tikus yang diinduksi aloksan
dan dicekok dengan ekstrak terbaik daun wungu
dengan dosis berbeda-beda berdasarkan hasil uji
toksisitas sub kronik yang dilakukan oleh
Setiawan (2011).
Aloksan diinduksi pada hari ke-0 dan
pencekokan ekstrak dilakukan mulai hari ke-4
sampai hari ke-14. Hari ke-4 dilakukan
pengukuran glukosa darah puasa untuk
memastikan hewan coba telah terinduksi
diabetes mellitus. Dosis aloksan yang
diinduksikan sebesar 150 mg/kg BB dan
dilakukan secara intraperitoneal. Kadar gula
darah juga diukur pada hari ke 14 setelah itu
dilakukan nekropsi untuk pengambilan
pankreas dan hati tikus.
9
Sediaan Histopatologi Pankreas (Humason
1967 dalam Ersa 2008)
Hewan coba dinekropsi di kandang
percobaan Departemen Biokimia. Sediaan
preparat histopatologi dilakukan di
laboratorium patologi Pusat Penelitian Satwa
Primata. Tahap sediaan preparat meliputi
pengambilan organ pankreas, fiksasi,
dehidrasi, penjernihan (clearing), pencetakan
(embedding), pemotongan, pewarnaan
(staining), penutupan sediaan, dan
pengamatan dengan mikroskop.
Organ pankreas yang diperoleh dari
nekrospi dipotong dengan ketebalan 5-7 mm
dan diletakkan dalam tissue cassette. Organ
yang telah dipotong direndam ke dalam
larutan fiksasi buffer neutral formalin (BNF)
10% selama 24 jam. Tahapan selanjutnya
adalah dehidrasi dengan merendam organ
hasil fiksasi ke dalam larutan alkohol dengan
konsentrasi bertingkat yaitu alkohol 70%,
80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut 100%.
Perendaman organ hasil fiksasi pada masing-
masing konsentrasi alkohol dilakukan selama
2 jam. Tahap selanjutnya adalah clearing
dengan merendam organ hasil dehidrasi pada
larutan xylol. Setelah dilakukan proses
clearing, maka dilakukan infiltrasi yaitu
proses pengisian parafin ke dalam pori pori
jaringan organ. Parafin yang digunakan adalah
berplastik yang memiliki titik lebur 58 .
Proses infiltrasi dilakukan 2 tahap yaitu
parafin 1 dan parafin 2, masing-masing
tahapan dilakukan selama dua jam agar porin-
pori jaringan terisi parafin dengan sempurna.
Persiapan sediaan histopatologi
dilanjutkan dengan proses embedding
(blocking) yang merupakan proses penanaman
spesimen organ ke dalam parafin yang dicetak
menjadi blok-blok parafin dalam wadah
khusus berupa tissue cassette atau blok besi.
Setelah parafin menjadi blok-blok maka
spesimen berparafin akan dipotong
menggunakan Rotary Mikrotom Spencer.
Potongan-potongan tersebut diletakkan di atas
penangas air dengan suhu 37 , kemudian
potongan terbaik diletakkan pada gelas objek
yang telah ditetesi perekat putih telur,
selanjutnya diinkubasi selama 24 jam dengan
suhu 56 untuk mencairkan parafin yang
melekat pada jaringan dan melekatkan
jaringan pada gelas objek secara sempurna.
Preparat yang telah di fiksasi pada gelas
objek diwarnai dengan Haematoksilin dan
Eosin. Proses awal pewarnaan adalah
memasukkan preparat ke dalam xylol 1 dan
xylol 2 selama dua menit. Proses dehidrasi
dilakukan dengan merendam pada larutan

alkohol 100% selama 2 menit,kemudian
direndam di alkohol 95% dan 80% masing-
masing selama 1 menit. Sampel kemudian
dibilas dengan air kran selama satu menit,
kemudian ke dalam pewarna Mayer’s
Hematoxyllin selama 10 menit, cuci lagi
dalam air kran selama 30 detik, dimasukkan
ke dalam litium karbonat selama 15-30 detik,
dan cuci dalam air kran selama dua menit.
Preparat dimasukkan ke dalam larutan
pewarna Eosin selama 2-3 menit, kemudian
cuci dalam air kran selama 30-60 detik untuk
menghilangkan Eosin yang masih tertinggal.
Setelah pewarnaan, preparat dimasukkan ke
dalam larutan alkohol 95% dan alkohol
absolut 1 sebanyak 10 celupan serta alkohol
absolut 2 selama dua menit. Tahap perekatan
(mounting) dilakukan setelah tahap pewarnaan
selesai. Tahap perekatan menggunakan zat
perekat permount dengan entelan, kemudian
ditutup dengan gelas penutup (cover glass).
Sediaan preparat kemudian diamati dengan
mikroskop cahaya (Humason 1967).
Sediaan Imunohistokimia Pankreas
Hewan coba dinekropsi di kandang
percobaan departemen biokimia untuk
mengambil organ hati dan pakreas. Sediaan
preparat histopatologi dilakukan di
laboratorium patologi Pusat Penelitian Satwa
Primata. Organ disimpan dalam keadaan
dingin saat menuju laboratorium patologi
Pusat Studi Satwa Primata.
Pewarna yang digunakan adalah Mayer
hematoxylin. Enzim yang digunakan adalah
avidin-biotin-peroksidase complex (ABC).
Sediaan jaringan akan diamati dengan
mikroskop imuno fluorense. Metode
pewarnaan yang digunakan adalah avidin
biotin peroksidase yang dikembangkan oleh
HSU, Raine, dan Fanger pada tahun 1981.
Prosedur pewarnaan berikut diadaptasi dari
Australian Animal Health Laboratory (AAHL
2011).
Organ pankreas yang diperoleh dari hasil
nekrospi tikus diabetes difiksasi di larutan
paraformaldehid 4%. Organ tersebut dibuat
sediaan slide yang telah melalui tahap
deparafinisasi. Larutan kalsium klorida 0.1 %
pH 7.8 direndam dalam penangas air suhu 37
. Setelah larutan bersuhu 37 , slide
direndam di dalam tripsin 0.1%, kemudian
slide direndam dalam air dingin suhu 4 .
Setiap slide diatur dalam rak khusus dan
dibilas dengan larutan PBS pH 7.4 selama 5
menit. Antiserum yang digunakan anti rat
insulin. Antiserum yang digunakan dilarutkan
dalam PBS pH 7.4 yang diberi susu skim
10
0.1% kemudian dilakukan checkerboard
titration untuk mengetahui konsentrasi
optimal. Antiserum ditambahkan pada slide
sebanyak 250 µL kemudian didiamkan selama
60 menit. Slide dibilas 3 kali dengan PBS
masing-masing selama 5 menit.
Hidrogen peroksida yang tersedia dalam
kit ditambahkan sebanyak 3 tetes lalu
diinkubasi selama 20 menit kemudian dibilas
3 kali dengan PBS selama 5 menit. Antibodi
sekunder yang telah dilabel dengan biotin
pada kit ditambahkan sebanyak 2-3 tetes dan
diinkubasi selama 30 menit. Slide dibilas 3
kali dengan PBS 5 menit. Avidin biotin
peroksidase kompleks pada kit ditambahkan
2-3 tetes kemudian slide diinkubasi selama 30
menit. Slide dibilas 3 kali dengan PBS
masing-masing selama 5 menit. Substrat
ABC pada kit ditambahkan sebanyak 2-3 tetes
dan diinkubasikan selama 2-5 menit. Slide
direndam dalam air mengalir selama 1-2
menit. Slide direndam dalam larutan
hematoksilin selama 5 menit. Slide direndam
dalam air yang mengalir selama 1-2 menit.
Slide direndam dalam larutan Scott selama 1-
2 menit. Slide direndam dalam air. Larutan
aqueous mounting medium diteteskan pada
coveslip dan kemudian ditutupkan pada slide.
Preparat dianalisis menggunakan mikroskop.
Pengukuran Kadar Lipid Peroksida
(Yagi 1994)
Pembuatan Kurva Standar. Kurva
standar dibuat dengan menggunakan larutan
stok pereaksi 1,1,3,3-tetrametoksi propana
(TMP) 6 M yang diencerkan dengan akuades
menjadi 0.5, 1.0, 1.5, dan 2.0 µM. Untuk
memudahkan pengenceran maka TMP 6 M
diencerkan menjadi 60 µM sebanyak 100 mL,
kemudian selanjutnya diencerkan sesuai
konsentrasi Masing-masing larutan dipipet
sebanyak 4 mL ke dalam tabung reaksi.
Setelah itu, masing-masing tabung
ditambahkan dengan 1 mL TBA 1.0% dalam
pelarut asam asetat glasial 50 %. Tabung
dipanaskan dalam penangas air pada suhu
95oC selama 60 menit, kemudian didinginkan
pada suhu kamar. Selanjutnya pada masing-
masing tabung ditambahkan 1.0 mL akuades
dan 5 mL n-butanol:piridin (15:1 v/v), diaduk
dengan vorteks, lalu disentrifugasi pada
kecepatan 3000 rpm (499.5 g) selama 15
menit. Lapisan atas yang tebentuk pada
larutan diambil, lalu serapannya diukur pada
panjang gelombang 532 nm dengan
spektrofotometer. Hasil pembuatan kurva
standar ini diperoleh persamaan garis(y=a+bx)
untuk menentukan konsentrasi lipid peroksida.