PROPOSAL PENELITIAN

RESPON HISTOPATOLOGIS HEPAR TIKUS PUTIH (Rattus YANG

DIINDUKSI DENGAN BENZO(α)PYREN (BAP) TERHADAP PEMBERIAN
EKSTRAK ETANOL DAUN BANGUNBANGUN
(Plectranthus ambonicus L. Spreng )

OLEH :

JOHANNES S MANURUNG
NIM.4153220009

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
2018
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan selama kurun waktu Februari 2019 sampai
dengan Mei 2019 di Laboratorium Biologi, Laboratorium Kimia, Ruang Hewan
Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Negeri Medan (UNIMED). Hewan uji tikus (Rattus novergicus) dipelihara dan diberi
perlakuan di ruang hewan. Pengamatan pasca perlakuan dilakukan di Laboratorium
biologi UNIMED.

3.2. Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini adalah meliputi alat
pemeliharaan tikus selama penelitian, alat ekstraksi daun bangun-bangun, alat bedah,
alat pembuatan preparat histologi dan alat pengamatan preparat histologi.
Alat yang digunakan untuk pemeliharaan tikus selama penelitian antara lain
kandang, jaring kawat penutup kandang, tempat makan dan minum tikus serta neraca
anaitik. Alat yang digunakan untuk ekstraksi daun bangun-bangun antara lain rotary
evaporator, beaker glass, erlenmeyer, lumpang alu, moisturebalance, hygrometer,
blender dan botol gelap untuk menyimpan hasil ekstraksi. Untuk proses pembedahan
menggunakan bak paraffin, jarum fiksasi, gunting bedah dan pinset. Alat yang
digunakan dalam pembuatan preparat histologi adalah object glass, deck glass, tissue
cassette, rotary microtome, oven, waterbath, platening table, staining jar, staining rack,
kertas saring, dan paraffin dispenser. Untuk pengamatan menggunakan mikroskop.

3.2.2. Bahan
Bahan-bahan yang dipakai dalam penelitian ini adalah daun bangun bangun
yang diperoleh dari Kota Sidikalang Kabupaten Dairi. Seluruh bagian tanaman bangun
bangun kecuali akar digunakan untuk memperoleh ekstrak etanol. Selain itu bahan yang
digunakan dalam penelitian ini meliputi Benzo(α)pyren (B(α)P), alcohol 70%, alkohol

1
96%, minyak jagung, formalin 10%, parafin, Hematoksisilin dan Eosin (HE), dan
entelan.

3.3. Populasi dan sampel

Tikus berumur dua bulan dengan berat badan 200-250 gram diperoleh dari
Universitas Sumatera Utara (USU), dipelihara sampai umur tiga bulan di Rumah Hewan
Laboratorium Kimia FMIPA UNIMED.
Hewan uji dipelihara berkelompok (1 ekor per kandang) dalam kandang ukuran
30 x 20 x 10 cm. Di bagian atas kandang dibuat kawat jaring ukuran 0,5 x 0,5 cm agar
tikus tidak dapat keluar dari kandang dan botol untuk minum tikus dengan ukuran 250
ml air. Dasar kandang ditaburi dengan sekam dengan ketebalan lebih kurang 1 cm.
Selama pemeliharaan, hewan uji diberi pakan berupa pellet (202C) dan air minum
secara ad libitum. Kandang dibersihkan sekali dalam dua hari.
Sampel penelitian dipilih secara acak yang dibagi dalam 5 kelompok.
Banyaknya jumlah sampel ditentukan dengan menggunakan rumus Frederer (Birawati,
2012).
Rumus Frederer:
(n – 1) (t – 1) ≥ 15
Keterangan:
n = besar sampel dalam tiap kelompok
t = banyaknya kelompok
Perhitungan jumlah minimal tikus yang digunakan dalam tiap kelompok:
(n – 1) (t – 1) ≥ 15
(n – 1) (5– 1) ≥ 15
(n – 1) 4 ≥ 15
4n – 4 ≥ 15
4n ≥ 19
n ≥ 4,75 ≈ 5
Berdasarkan perhitungan tersebut, dalam percobaan ini digunakan sampel
sebesar 5 ekor tikus putih untuk tiap kelompok, sehingga jumlah total sampel yang
digunakan adalah 25 ekor. Satu kelompok berjumlah 5 ekor tikus.

2
3.4. Prosedur Kerja
3.4.1. Penyediaan Kandang
Kandang yang digunakan terbuat dari bahan plastik berbentuk persegi panjang
yang berukuran 30 x 20 x 10 cm berjumlah 25 buah. Di bagian atas kandang dibuat
kawat jaring ukuran 0,5 x 0,5 cm agar tikus tidak dapat keluar dari kandang.Di dalam
kandang terdapat botol untuk minum tikus dengan ukuran 200 ml air. Dasar kandang
ditaburi dengan sekam dengan ketebalan lebih kurang 1 cm guna untuk menyerap urin
dan kotoran tikus. Kandang dibersihkan sekali dalam dua hari.

3.4.2. Aklimatisasi hewan uji

Langkah awal dalam penelitian ini adalah mengaklimatisasi tikus percobaan
selama 2 minggu. Aklimatisasi bertujuan untuk menyesuaikan kondisi fisiologis tikus
dengan lingkungan baru di tempat penelitian rumah hewan FMIPA UNIMED.
Parameter keberhasilan aklimatisasi dalam penelitian adalah tidak terjadi perubahan
signifikan dari berat badan tikus dalam kisaran 200-250 gram.
Pakan dan minuman tikus deberikan setiap paginya secara ad libitum. Pakan
berupa pellet jenis 202 C di tempatkan pada tempat pakan yang disediakan dalam setiap
kandang. Air minum disediakan dalam botol minum ukuran 200 ml.

3.4.4. Prosedur Pemberian Ekstrak Etanol Daun Bangun bangun

3.4.4.1. Pembuatan simplisia
Sebanyak 5 kg daun daun bangun bangun segar dipisahkan dari tangkainya
dicuci bersih, ditiriskan, dikeringkan dalam ruangan dan dibalik-balikkan. Daun bangun
bangun di keringkan ditempat yang terlindung dari cahaya matahari, Pengeringan
dengan diangin-anginkan dalam suhu ruangan berkisar 25°- 30°C℃( suhu kamar ).
Kadar air dalam pengeringan tidak boleh lebih dari 10%. Daun akan dikeringkan hingga
mempunyai berat 10% dari berat basah yaitu 500 gr. Setelah kering daun dihaluskan
dengan menggunakan blender untuk memperluas permukaan agar serbuk daun dapat
secara maksimal di ekstrak. Setelah mendapat serbuk daun bangun bangun lalu di
simpan dalam wadah plastik (Depkes RI, 2000).

3
 Pengeringan bertujuan untuk menghilangkan atau mengurangi kandungan air
yang dikandung dalam tanaman sehingga kandungan bahan aktif dapat terjaga dari
kerusakan oleh hidrolisis air, untuk mencegah tumbuhnya jamur, bakteri, dan
menghentikan kerja enzim yang menyebabkan perubahan komposisi kimiawi tanaman
tersebut. Setelah mendapat serbuk daun bangun bangun lalu di simpan dalam wadah
plastik.

3.4.4.2. Maserasi
Serbuk kering (simplisia) yang telah disimpan di wadah plastik tersebut
dimaserasi menggunakan pelarut etanol 70% caranya yaitu sebanyak serbuk kering
dimasukkan ke dalam wadah maserasi, ditambahkan larutan penyari (etanol) dengan
rasio antara serbuk dan larutan sebanyak 1:10 dan diaduk. Dalam prosesnya 500 gram
simplisia ditimbang kemudian dimasukkan kedalam tiga bejana masing-masing berisi
200 gram, 150 gram, dan 150 gram. Simpilisia dimaserasi dengan perbandingan pelarut
1:10, sehingga masing-masing bejana dimaserasi dengan pelarut sebanyak 2 liter,1,5
liter, 1,5 liter.
Maserasi dilakukan selama 4 hari, dengan pengadukan dilakukan setiap hari,
setelah itu dilakukan penyaringan. Hasil penyaringan dari ketiga bejana dikumpulkan
kemudian diuapkan menggunakan Rotary evaporator pada suhu 40-600C sampai
volume ekstrak tetap. Ekstrak yang diperoleh diuapkan lagi dengan penangas air pada
suhu 40-60oC sampai diperoleh ekstrak kental yang sulit untuk dituang. Ekstrak kental
tersebut di keringkan lagi hingga berbentuk serbuk. Setiap dosis ekstrak dilarutkan
dalam 1 ml CMC 1%, Carboxymethyl cellulose (CMC) adalah suspending agent yang
berfungsi mensuspensikan zat yang tidak larut. Biasanya digunakan dalam kadar 1%
atau 2% (Anief, 1995).

3.4.4.3. Penentuan Dosis Ekstrak Etanol Daun Bangun-bangun

Dosis ekstrak air bangun-bangun untuk tikus ditentukan berdasar konsumsi
harian masyarakat Batak yaitu 150 gr/50 Kg BB, kemudian dikonversikan ke tikus.
Konversi dosis dilakukan dengan melihat tabel konversi yaitu ditentukan pada berat
badan manusia 70 Kg dan tikus 200.g. Oleh sebab itu dosis di atas sama dengan 210

4
gr/70.Kg.BB, dan 250 g/50 kg BB manusia. Berdasarkan perhitungan konversi dosis
diperoleh konversi dosis untuk manusia-70 Kg ke tikus-200 gr adalah 0,018 sehingga
dosis untuk tikus adalah 0,018 x 210 g atau sebesar 19 g/Kg BB tikus. Dengan
perhitungan yang sama, untuk dosis 250.g/50 Kg BB manusia, ditetapkan dosis
perlakuan adalah 31,5 g/Kg BB tikus (Silitonga, 2014).

3.4.4.4. Cara Pemberian Ekstrak Etanol Daun Bangun-bangun

Pemberian ekstrak ekstral etanol daoun bangun-bangun diberikan dilakukan
dengan cara dicekok (per oral) menggunakan sonde lambung.

1.4.5. Cara Induksi BaP

Penelitian Agata (2017) membuktikan bahwa benzo(α)pyrene dapat
menyebabkan tumor hati pada model hewan percobaan . Pemberian benzo(α)pyrene
dosis 0,3mg/20gBB/hari selama 10 hari secara sub-kutan dapat menginduksi terjadinya
kanker dan konsumsi benzo(α)pyrene dengan dosis sebesar 120ppm/kgBB/hari selama
kurang dari 14 hari dapat menyebabkan kematian (Nansi, 2015).
Dalam penelitian ini Benzo(α)pyrene 0,3mg/20gBB dilarutkan dalam 0,2 mL
minyak jagung tanpa pemberian bahan uji selama 10 hari dengan cara diinduksi atau
disuntikan pada jaringan subkutan mencit di bagian tengkuk.

3.5. Desain Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL).
Hewan uji tikus dibagi menjadi 5 kelompok yaitu :

Kelompok Ketarangan Jumlah Tikus

I (Kontrol Normal) Diberi pakan normal dan minum sampai akhir
5 ekor
penelitian
II (Kontrol Negatif) Diinduksi Benzo(α)pyrene 0,3mg/20gBB/hari 5 ekor
selama 10 hari tanpa pemberian Ekstrak
Etanol Daun Bangun-bangun sampai akhir

5
 penelitian
III (K1) Diinduksi Benzo(α)pyrene 0,3mg/20gBB/hari
selama 10 hari dan diberi Ekstrak Etanol
5 ekor
Daun Bangun-bangun 0,0315 g/g BB/hari
selama 20 hari
IV (K2) Diinduksi Benzo(α)pyrene 0,3mg/20gBB/hari
selama 10 hari 0,0630 g/g BB/ hari selama 20 5 ekor
hari
V (K3) Diinduksi Benzo(α)pyrene 0,3mg/20gBB/hari
selama 10 hari 0,0945 g/g BB/ hari selama 20 5 ekor
hari

3.6. Pembuatan preparat histologi

Pada akhir penelitian seluruh tikus dikorbankan. Tikus difiksasi menggunakan
klorofom sebelum melakukan pembedahan. Setelah pembedahan hepar segera diambil.
Hepar selanjutnya dicuci dengan larutan PBS dan difiksasi dengan formalin selama 24
jam. Sampel hepar dipotong kecil dan didehidrasi di dalam seri larutan alkohol dengan
konsentrasi bertingkat makin pekat (70% sampai 100%) selama 24 jam. Sampel
selanjutnya dijernihkan dengan xylol selama 6 jam. Setelah proses penjernihan
dilakukan embedding dengan parafin yang telah dicairkan pada 58 – 60 ºC selama 6
jam. Selanjutnya blok parafin dipotong serial pada ketebalan 5 µm dengan
menggunakan mikrotom. Potongan tersebut dimasukkan dalam air hangat dan
dipindahkan ke atas slide kaca. Sediaan selanjutnya diwarnai dengan teknik pewarnaan
Hematoxylin-Eosin. Dalam pewarnanaan sediaan setelah dihilangkan parafinnya dan
xylol yang tesisa dihilangkan dengan menggunakan kertas filter dan berturut-turut
dicelupkan beberapa kali ke dalam alkohol 96%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 30%,
akuades, dan dimasukan dalam Ehrlich’s hematoxylin selama 3-7 detik. Proses
selanjutnya sediaan dicuci dengan air mengalir selama 10 menit. Selanjutnya dicelupkan
ke akuades, alkohol 30%, 50%, 60%, 70% beberapa kali celupan lalu dimasukkan
dalam eosin Y 1-2% dalam alkohol 70% selama 1-2 menit. Setelah itu dicelupkan ke
alkohol 70%, 80%, 90%, 96% beberapa celupan, lalu dikeringkan di antara kertas filter

6
dan dimasukkan ke dalam xylol selama 10 menit. Selanjutnya sediaan ditetesi dengan
entelan dan ditutup dengan cover glass dan diberi label. Sebagai kontrol hepar tikus
yang dibuat preparat berasal dari tikus sehat.

3.7. Parameter yang diamati

Parameter yang diamati adalah gambaran histologi hepar tikus putih (Rattus
novergicus) dan bobot hepar tikus putih (Rattus novergicus). Derajat histopatologi hepar
yang digunakan berdasarkan penelitian Uji Toksisitas Akut dan Subakut yang dilakukan
Maretnowati et al. (2005) yaitu a) tingkat perubahan masih dalam keadaan normal
memiliki skor 0 belum terjadi perubahan struktur histologi; b) tingkat perubahan
kategori ringan (Mild) memiliki skor 1 dengan kerusakan kurang dari sepertiga dari
seluruh lapang pandang; c) Tingkat perubahan kategori sedang (Moderate) memiliki
skor 2 dengan kerusakan sepertiga hingga dua pertiga dari seluruh lapang pandang; d)
Tingkat perubahan kategori berat (Severe) memiliki skor 3 dengan kerusakan lebih dari
dua pertiga dari seluruh lapang pandang.

3.8. Analisis Statistik

Data yang didapat dari setiap parameter (variabel) pengamatan dicatat dan
disusun ke dalam bentuk tabel. Data kuantitatif (variabel dependen) yang didapatkan,
diuji kemaknaannya terhadap pengaruh kelompok perlakuan (variable independen)
dengan bantuan program statistik komputer SPSS release 15.Urutan uji untuk setiap
parameter diawali dengan uji normalitas dan uji homogenitas. Apabila hasil uji
normalitas dan uji homogenitas menunjukkan p>0,05 maka dilanjutkan uji sidik ragam
(ANOVA) satu arah untuk data dengan pengamatan berulang (lebih dari 2 kali) atau
lebih dari 2 perlakuan. Jika berbeda nyata (p<0,05) maka dilanjutkan dengan uji analisis
Post Hoc-Scheffe taraf 5%.