BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperiment dengan desain pretest-

posttest matched control group. Variabel bebas penelitian ini yaitu

peningkatan dosis ekstrak etanol daun sembung, parameter yaitu waktu

bertahan berenang mencit sesudah perlakuan dalam satuan detik.

Variabel yang dikendalikan meliputi berat badan, galur, umur, dan jenis

kelamin mencit, suhu air dalam aquarium, kedalaman serta ukuran

aquarium.

3.2 Kerangka Konsep

Variabel independent Variabel Dependent

Kafein 100 mg/kgBB

Dosis ekstrak tanaman daun
sembung (Blumea Efek tonikum pada
balsamifera (L)) : mencit dengan metode
75mg/20grBB Natatory Exhaustion
125mg/20grBB
175mg/20grBB

Bagan 2.2 Kerangka Konsep

36
 37

3.3 Populasi dan Sampel Penelitian

3.1.1 Populasi

Populasi pada penelitian ini adalah mencit jantan (Mus musculus)

yang diambil di Kota Palembang.

3.1.2 Sampel

Sampel pada penelitian ini adalah tanaman daun sembung (Blumea

balsamifera (L)).

3.4 Variabel Penelitian

3.4.1 Variabel Dependent :

Variabel Dependent dalam penelitian ini adalah efek tonikum pada

mencit dengan metode Natatory Exhaustion.

3.4.2 Variabel Indepedent:

Variabel Independent dalam penelitian ini adalah dosis ekstrak

tanaman sembung (Blumea balsamifera (L)).

3.5 Etika Penelitian

Dalam penelitian ini menggunakan etika sebagai berikut (Ardana,

2015):

1. Etika pemeliharaan terhadap hewan percobaan

Dengan cara membuatan kandang tikus dengan ukuran yang

sesuai, kandang di tempatkan di ruang laboratorium farmakologi

 38

STIK Siti Khadijah Palembang dengan lingkungan yang nyaman

sebagai tempat tinggal seperti, venitilasi, lampu penerangan,

vkebersihan kandang, suhu, kelembaban, dll.

2. Etika menangani hewan percobaan

Pada saat penelitian, peneliti tidak boleh membuat hewan

percobaan mengalami depresi/stress, karena hewan tersebut akan

lebih agresif dan dapat memberontakan bila merasa terganggu.

Penelitian harus membuat hewan tersebut merasa nyaman dengan

cara mengelusnya sehigga peneliti lebih mudah untuk melakukan

pengamatan

3. Memberikan masa adaptasi sebelum diberikan pengamatan Hewan

percobaan diadaptasi selama beberapa hari dan diberikan pakan

standar sebanyak 12-20 g/ hari dan air minum secukupnya.

Peneliti melaksanakan penelitian sesuai dengan prosedur peneliti

guna menlaksanakan hasil yang bermanfaat semaksimal

mungkin.

3.6 Instrumen Penelitian

3.6.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah : alat gelas

laboratorium, timbangan listrik, oven, blender, ayakan no 40 mesh,

bejana maserasi, seperangkat alat rotary evaporator, pipet tetes, pipet

kapiler, timbangan hewan uji, tisu, oral sonde, termometer, corong,

 39

perkamen, spatula, hairdrayer, kertas perkamen, stopwatch, incenerator,

aquarium ukuran 50 cm x 30 cm x 20 cm.

3.6.2 Bahan Penelitian

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun

sembung (Blumea balsamifera (L)) yang diambil dari Tanjung Kurung

Kecamatan Abab Kabupaten Penukal Abab Lematang Ilir, etanol 70%,

kafein, CMC-Na, Aquadest, asam sulfat, NaOH, FeCl3, Etil Asetat, asam

klorida.

3.6.3 Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan ialah 25 ekor mencit jantan dengan usia

2-3 bulan, dengan berat badan antara 20-40 gram. Sebelum percobaan

dimulai, terlebih dahulu mencit dipelihara selama 1 minggu depan

perlakuan yang baik untuk menyesuaikan dengan lingkungan.

3.7 Teknik Pengumpulan Data

3.7.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Farmakologi Farmasi STIK

Siti Khadijah Palembang pada bulan April- Mei 2020.

3.7.2 Pembuatan Simplisia

Daun sembung yang masih segar dibersihkan dari kotoran dengan

cara dicuci dibawah air mengalir kemudian ditiriskan, ditimbang berat

basah. Daun sembung kemudian dirajang dan dikeringkan di dalam

 40

lemari pengering, setelah kering, dilakukan sortasi kering dan ditimbang

berat kering. Simplisia diserbukkan dan disimpan dalam wadah plastik.

3.7.3 Identifikasi Tanaman

Identifikasi tanaman dapat dilakukan di Mds Kebun Herbal

Kamaluddin Talang Pupui, Sungai Rengas, Kelurahan Pulokerto,

Kecamatan Gandus, Palembang.

3.7.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan

organoleptik dan makroskopik (Ditjen POM, 1979).

1. Pemeriksaan Organoleptik dan Makroskopik

Pemeriksaan makroskopik dan organoleptik dilakukan dengan

mengamati bentuk, bau dan rasa dari daun sembung segar dan simplisia

daun sembung.

3.7.5 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak

Uji fitokimia dengan penambahan reagen untuk mengetahui

kandungan golongan senyawa alkaloid, flavonoid dalam ekstrak.

a. Uji Flavonoid

Larutan ekstrak uji direaksikan dengan NaOH 10% setelah

dicampurkan/direaksikan maka akan terbentuk warna kuning cerah

yang spesifik.

b. Uji Alkaloid
 41

Larutan percobaan yang dengan alkaloid membentuk senyawa

adisi yang tidak larut: Mayer L.P, Dragendorff L.P dan

Bouchardat.

Cara percobaan :

Timbang sebanyak 500 mg serbuk simplisia, lalu tambahkan 1 ml

asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, kemudian dipanaskan di atas

penangas air selama 2 menit, dinginkan dan saring, kemudian

filtrat dipakai untuk uji alkaloid. Dan diiambil 3 tabung reaksi, lalu

masukkan kedalam masing-masing tabung reaksi sebanyak 0,5 ml

filtrat.

Pada tabung I : ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan

terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.

Pada tabung II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendroff

akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan.

Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat,

akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.

Alkaloid dikatakan positif jika memiliki endapan atau

kekeruhan pada kedua atau ketiga dari percobaan diatas (Depkes

RI,1995).

c. Uji Steroid dan Terpenoid

 42

Sebanyak 1 gr serbuk simplisia digerus dengan 5 ml eter, setelah

itu disaring dengan menggunakan pipet yang disumbati dengan

kapas. Filtrate yang dihasilkan ditempatkan dalam cawan penguap

dan dibiarkan menguap hingga kering. Kemudian teteskan 2 hingga

3 tetes pereaksi Liberman Burchard terbentuknya warna biru hijau

yang menunjukkan adanya senyawa golongan steroid dan

terpenoid.

d. Uji Tanin

Larutan ekstrak uji direaksikan dengan larutan besi (III) klorida

(FeCl3) 10%, jika terjadi warna biru tua, biru kehitaman atau hitam

kehijauan menunjukkan adanya senyawa tanin.

e. Uji Saponin

Larutan ekstrak dimasukkan kedalam tabung reaksi, lalu di kocok

dengan kuat dan akan terbentuk banyak buih yang stabil dan tidak

berkurang sampai 10 menit setinggi 1-10 cm.

3.7.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Sembung

Serbuk simplisia daun sembung diekstraksi dengan metode

maserasi. Sebanyak 500 gr serbuk simplisia daun sembung dimasukkan

kedalam wadah berwarna gelap, tambahkan cairan penyari etanol 70%

sebanyak 3.750 mL, kemudian ditutup, dan diamkan selama 5 hari

terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk. Setelah 5 hari campuran

serbuk simplisia dan etanol 70% diserkai. Hasil serkaian disebut sebagai

maserat I. Ampas ditambahkan etanol 70% sebanyak 1.250 mL kemudian

 43

ditutup dan diamkan selama 2 hari, terlindung cahaya, sambil sesekali

diaduk. Setelah 2 hari, campuran ampasdan etanol 70% sebagai maserat

II. Maserat I dan II dicampurkan, lalu diuapkan menggunakan rotary

evaporator dengan suhu 550C sampai diperoleh ekstrak kental.

3.7.7 Pemilihan dan Penyiapan Hewan Uji

a. Dipilih mencit dengan kriteria antara lain :

1) Kriteria yang akan dipilih yaitu : galur yang sama, jenis kelamin

jantan dengan usia 2-3 bulan, bobot badan berkisar antara 25-40

gram, serta kondisi sehat ( aktif atau tidak cacat).

2) Kriteria eliminasi yaitu apabila mencit tidak dapat berenang

dengan baik, mencit mati selama masa adaptasi, bobot badan

mencit menurun ( dibawah 25 gram), mencit mati selama

diberikan perlakuan.

b. Hewan uji yang telah dipilih berdasarkan kriteria tersebut,

dipelihara dengan kondisi yang sama meliputi kandang, makanan,

minuman dan perlakuan-perlakuan lainnya. Aklimatisasi hewan uji

dalam pemeliharaan selama satu minggu sebelum hewan

mendapatkan perlakuan. Hewan uji sebelum diberi perlakuan

dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam namun masih diberikan

minum ( Yulianita, 2013).

c. Sebelum selesai masa aklimatisasi, dilakukan uji motorik terhadap

seluruh mencit. Uji motorik tersebut bertujuan untuk menyeleksi

mencit yang akan dijadikan objek dalam pengambilan data

 44

penelitian. Uji motorik dilakukan dengan cara merenangkan

beberapa menit sekaligus dalam aquarium kaca selama 10 menit.

Mencit yang tidak memiliki kemampuan berenang yang baik tidak

disertakan dalam pengujian dan dalam pengambilan data (Yulianita

dkk, 2013).

d. Kondisi ruangan yang digunakan untuk hewan percobaan

hendaknya memenuhi persyaratan suhu, kelembaban, cahaya, dan

kebisingan yang sesuai dengan kebutuhan hidup hewan uji, yaitu

suhu ruangan diatur menjadi 22º ± 3º C, dengan kelembaban relatif

30-70%, dan penerangan 12 jam terang 12 jam gelap. Ruangan

harus selalu dijaga kebersihannya. Hewan diberi pakan yang sesuai

standar laboratorium dan diberikan tanpa batas (ad Iiibitum).

Hewan dipelihara dalam kandang yang terbuat dari material yang

kedap air, kuat dan mudah dibersihkan, ruang pemeliharaan bebas

dari kebisingan. Luas area kadang ekor hewan mencit (berat 15-

25g) menurut Cage Space Guidelines For Animals Used In

Biomedical Research (2008) adalah 77,4 cm2, tinggi 12,7 cm.

Pemberian pakan dan minum hewan uji : Adaptasi hewan uji

dilakukan di laboratorium selama 7 hari untuk penyesuaian

lingkungan. Pakan dan minum beupa pelet BR- 1 yang

mengandung komponen air maksimal 66%, abu maksimal 7%

kalsium 0,9-11%, fosfor 0,6-0,9% dan minum air suling, air suling

diberikan ad libitum. Ketentuan yang tepat harus dibuat untuk

 45

pembuangan dan sanitasi lainnya atau persyaratan komite

keamanan hayati nasional, departemen kesehatan, dan badan

lingkungan nasional.

e. Terminasi Hewan Uji Pasca Penelitian

1) Hewan uji dimasukkan kedalam wadah transparan yang memiliki

tutup dengan satu lubang kecil (seperti toples).

2) Kloroform disemprotkan kedalam wadah melalui lubang kecil

pada tutup, kemudian lubang tersebut ditutup.

3) Mencit dibiarkan beberapa detik hingga terbias.

4) Kemudian mencit diletakkan diatas kain dan ditutup kain

5) Selanjutnya tangan kiri memegang leher hingga kepala atas

mencit, tangan kanan memegang bagian ekor.

6) Lalu tarik bagian kepala dan pangkat ekor hingga terjadi

diskolasi tulang leher.

7) Pastikan hewan uji telah mati dan kemudian dikubur menjadi

satu pada kedalaman 50cm.

f. Sampel penelitian sebanyak 25 ekor mencit putih jantan yang

dipilih secara acak dibagi menjadi 5 kelompk (3 kelompok diberi

perlakuan dan 2 kelompok kontrol) sehingga 1 kelompok perlakuan

terdiri 5 ekor mencit. Penentuan untuk kelompok sampel menurut

rumus Federer, yakni dengan jumlah sampel minimal 5 sampel

untuk tiap kelompoknya.

 46

Menurut rumus Federer (1967), rumus penentuan sampel untuk uji

eksperimental adalah :

(t – 1) (n – 1 ) ≥ 15

Dimana t merupakan jumlah kelompok percobaan dan n

merupakan jumlah pengulangan atau jumlah sampel tiap kelompok.

Penelitian ini mengguanakan 5 kelompok perlakuan sehingga

perhitungan sampel sebagai berikut :

(5 – 1) (n – 1) ≥ 15

(4n – 4) ≥ 15

(4n) ≥ 19

(n) ≥ 4,75

Jadi, sampel yang digunakan pada penelitian ini sebanyak 5 ekor

mencit (n) ≥ 4,75 dan jumlah kelompok yang digunakan adalah 5

kelompo sehingga penelitian ini menggunakan 25 ekor mencit

(Mus musculas) jantan galur wistar.

3.7.8 Pembuatan Larutan dan Suspensi

a. Pembuatan Larutan CMC-Na 0,5%

CMC-Na yang digunakan adalah CMC-Na 0,5 % dengan dosis

0,5g/kgBB.
 47

Mencit 20 g = 20 gr/1000 gr x 0,5 gr = 0,01 gr

Timbang dengan seksama 5 gr CMC-Na ditsburkan kedalam

lumpang yang berisi + 10 mlaquadest panas. Dinginkan selama 15

menit lalu gerus hingga diperolwh massa yang tansparan, lalu gerus

sampai homogen, diencerkan dengan aquadest, dihomogenkan dan

masukkan kedalam labu ukur 100 ml, cukupkan volumenya hingga

garis batas.

Dosis pemberian pada mencit 20 gr = 0,01 gr/5 gr x 100 ml = 0,2

ml

b. Pembuatan Larutan Kafein 100 mg∕kg BB

Konversi dosis ke mencit = 100 mg x 0,0026 = 0,26 mg x 1000 gr

20 gr

= 13mg

Timbang kafein secara seksama 13 mg kemudian dimasukkan

kedalam lumpang gerus hingga homogen, kemudian masukkan

kedalam labu ukur 10 ml lalu tambahkan Na-CMC 0,5%sampai

batas tanda dan dikocok hingga larut.

Dosis pemberian pada mencit = 0,26 mg/13 mg x 10 ml = 0,2 ml

c. Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Sembung

Perhitungan ekstrak etanol daun sembung, untuk mencit dengan

berat badan 20 gr = 0,02 kgBB

Untuk 72 mg/20grBB = 75mg x 10 = 750mg (0,75 gr)

X = 750 mg/10 ml Na-CMC

 48

Untuk 125mg/20grBB = 125mg x 10 = 1,250mg (1,25 gr)

X = 1,250 mg/10 ml Na CMC

Untuk 175 mg/kgBB = 175 mg x 10 = 1,750 mg (1,75 gr)

X = 1,750 mg/10 ml Na CMC

Masing – masing ekstrak dibuat suspensi dengan CMC-Na 0,5%

dengan dosis yang berbeda, dosis 75mg∕20grBB, 125mg/20grBB,

175mg∕20grBB, masing – masing dosis ditimbang dan dicampurkan

dengan CMC-Na 0,5% sampai homogen hingga volume 10 ml.

Jadi dosis pemberian untuk mencit 20 gr = 20 gr/1000 gr x 10 ml =

0,2 ml

3.7.9 Uji Efek Tonikum Ekstrak Etanol Daun Sembung

Uji efek tonikum dilakukan menggunakan uji renang kemudian

dilihat waktu pada ketahanan berenamg mecit. Metode uji berenang yang

digunakan adalah Natatory Exhaustion. Sebanyak 25 ekor mencit

diadaptasi lingkungan di laboratorium selama 1 minggu. Mencit

dipuasakan selama 8 jam tetapi masih diberi minum. Setelah diadaptasi

mencit dilatih berenang dalam aquarium dengan suhu air dipertahankan

pada 30±1o C. Latihan berenang dilakukan 3 kali selama seminggu.

Mencitb dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan berbeda-beda yaitu :

Kelompok 1 : Kontrol negatif diberikan CMC-Na 0,5%

Kelompok 2 : Kontrol positif diberikan kafein dosis 100 mg∕kg BB

Kelompok 3 : Diberikan EEDS dosis 75 mg∕20gr BB

Kelompok 4 : Diberikan EEDS dosis 125 mg∕20gr BB

 49

Kelompok 5 : Diberikan EEDS dosis 175 mg∕20gr BB

Seluruh perlakuan diberikan secara per oral selama 14 hari. Sehari

setelah perlakuan terakhir dilakukan pengujian waktu bertahan berenang

mencit. Pengujian ketahanan berenang mencit sebelum perlakuan

dilakukan sehari setelah latihan berenang terakhir. Tenggelamnya kepala

mencit dan posisi tubuh tidak lagi horizontal dengan permukaan air

hingga posisi keempat kaki mecit lambat bergerak selama tidak lebih dari

7 detik yang merupakan pananda kelelahan. Waktu bertahan berenang

mencit dicatat (Hu dkk, 2010). Data waktu bertahan berenang mencit

sesudah perlakuan dianalisis (Wahyuni dan Kusumawati, 2008).

3.8 Analisa Data

Data uji efek tonikum adalah waktu bertahan berenang mencit

sesudah pemberian sediaan uji selama 14 hari. Data tersebut diuji

normalitas dengan metode Shapiro-Wilk. Hasil uji terdistribusi

normalitas menghasilkan nilai yang signifikan (p>0,05). Selanjutnya,

analisa data yang digunakan hasil uji normalitas menghasilkan nilai

signifikan (p<0,05) dan hasil uji homogenitas menghasilkan nilai

signifikan (p<0,05), maka analisa data yang digunakan adalah yaitu

menggunakan uji One Way ANOVA. Indikator adanya perbedaan efek

peningkatan waktu berenang antar kelompok perlakuan ditentuan oleh

nilai signifikan (p<0,05) (Nurul Mustaufiah, 2015). Data waktu bertahan

berenan mencit sesudah pemberian CMC-Na 0,5%, kafein dan ekstrak

 50

etanol daun sembung (75, 125, 175 mg∕20gr BB) dianalisis adanya

perbedaan yang bermakna waktu bertahan berenang mencit sesudah

perlakuan ditentukan dengan nilai singnifikan (p<0,05). Ekstrak etanol

daun sembung dinyatakan mempunyai efek tonikum apabila ada

perbedaan yang bermakna (p<0,05) waktu bertahan berenang mencit

sesudah pemberian sediaan uji.

3.9 Definisi Operasional

No Variabel Definisi Alat Cara Hasil Skala

Dependent Ukur Ukur
Ukur Ukur
1. Dosis Jumlah Alat Penimba Dalam Rasio
ektrak dosis timba ngan
dosis
daun ektrak ng
sembung daun ekstrak :
(Blumea sembun
75
balsamifer g
a (L)) (Blume mg/20gr
a
BB, 125
balsami
fera mg/20gr
(L))
BB dan
175
mg/20gr
BB
Independent
2. Tonikum Uji efek Natat Seluruh Tidak Rasio
tonikum ory perlakuan
lebih dari
dilakuk Exhau diberikan
an stion secara 7 detik
menggu per oral
nakan selama
uji 14 hari
renang
kemudi
an
dilihat
 51

waktu
pada
ketahan
an
berena
mg
mecit

3.10 Hipotesis
H0 : ekstrak etanol daun sembung tidak meiliki efek tonikum
H1 : ekstrak etanol daun sembung memiliki efek tonikum

3.11 Alur Penelitian

Mencit diaklimatisasi selama 7 hari di Laboratorium Farmakologi

STIK Siti Khadijah Palembang

Mencit dipuasakan selama 8 jam tetap diberikan minum)

Pembuatan larutan CMC-Na 0,5% sebanyak 0,5 gr

Pembuatan larutan kafein 100 mg/kgBBsebanyak 0,1 gr

Pembuatan suspensi EEDS (Ekstrak etanol daun sembung) dengan dosis

yang berbeda dan masing-masing dosis ditimbang dan dicampur dengan
CMC-Na 0,5% sampai homogen hingga volume 10ml
 52

Uji efek tonikum digunakan dengan metode Natatory

exhaustion

Mencit di kelompokkan menjadi 5 perlakuan

yang berbeda-beda

Kel I 5 Kel II 5 Kel III 5 Kel IV 5 Kel V 5

ekor ekor ekor ekor ekor
mencit mencit mencit mencit mencit

Perlakuan diberikan obat secara oral

Kel I (-) Kel II IV (+) Kel III Kel IV Kel V

CMC-Na kafein dosis EEDS EEDS EEDS(Ekstr
0,5% 100 mg/kg (Ekstrak (Ekstrak ak Etanol
BB Etanol Daun Etanol Daun Daun
Sembung) 75 Sembung) Sembung)
mg/20grBB 125 175
mg/20grBB mg/20grBB

Analisis data uji tonikum adalah

waktu bertahan berenang
mencit sesudah pemberian
sediaan uji selama 14 hari

Analisis data menggunakan

uji One Way ANOVA
 53

Bagan 3.3 Alur Penelitan