III.

METODE PENELITIAN

A. Materi dan Bahan

1. Hewan coba

Hewan coba yang digunakan pada penelitian adalah tikus putih (Rattus

norvegicus) jantan galur Sprague dawley berjumlah 30 ekor dengan umur 2-3

bulan dan berat badan 160-200 gram dalam keadaan normal dan sehat. Hewan

coba didapatkan dari Laboratorium Hewan Coba Fakultas Kedokteran dan

Ilmu-ilmu Kesehatan (FKIK), Universitas Muhammadiyah Yogyakarta

(UMY). Setiap kelompok percobaan terdiri dari 5 ekor dan cadangan 1 ekor.

Hewan coba dipelihara dalam lingkungan dengan suhu 22 + 3 °C dan

kelembaban 30% dan siklus gelap-terang selama 12 jam. Hewan coba

ditempatkan dalam kandang dengan bahan, bentuk dan ukuran yang sama,

mendapat makanan dan minuman dengan jenis, jumlah dan komposisi yang

sama secara ad libitum (Willems, 2009).

Jumlah hewan coba disesuaikan dengan banyaknya ulangan yang

dilakukan. Jumlah ulangan ditentukan berdasarkan rumus Federal sebagai

berikut (Puspitawati et al., 2008) :

(k-1) (n-1) > 15

Keterangan: k : jumlah perlakuan

n : jumlah ulangan
 33

Sehingga perhitungannya :

(5-1) (n-1) ≥ 15

4n ≥ 19

n≥5

Jumlah sampel dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, maka jumlah

sampel yang dibutuhkan setiap kelompok sebesar ≥ 5 ekor dengan estimasi

1 n
drop out (DO) 20% maka besar sampel dihitung dengan formula n =
(1−f )

sehingga jumlah hewan coba tiap kelompok sebesar 6 ekor dan total sampel

yang dibutuhkan sebesar 30 ekor (Sastroasmoro dan Ismael, 2011).

2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari:

a. Alloksan monohidrat

Alloksan berfungsi sebagai diabetogen dengan dosis 150 mg/kgBB,

dosis tunggal secara intraperitoneal. Pada tikus putih (Rattus norvegicus)

jantan galur Sprague Dawley, pemberian dosis tersebut telah terbukti

menyebabkan peningkatan kadar gula darah yang dapat menyebabkan

nefropati diabetik (Triastuti et al., 2009). Alloksan didapatkan dari Sigma

Chemical®.

b. Daging Buah Mahkota dewa

Daging buah mahkota dewa dibuat dalam bentuk ekstrak dengan

dosis 250 mg/kgBB. Dosis 250 mg/kgBB merupakan dosis ekstrak daging
 34

buah mahkota dewa yang dapat mengurangi hipertrofi ginjal pada tikus

diabetik (Triastuti et al., 2009). Ekstrak diberikan dalam bentuk ekstrak

methanol dan ekstrak air. Daging buah mahkota dewa yang digunakan

dalam penelitian ini didapatkan dari tanaman yang tumbuh di daerah

Kaliurang, Yogyakarta yang sudah dikeringkan oleh produsen Merapi

Herbal dan dideterminasi di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan,

Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman (UNSOED). Pembuatan

ekstrak daging buah mahkota dewa dilakukan di Laboratorium Biologi,

Jurusan Farmasi, FKIK, UNSOED. Pembuatan ekstrak daging buah

mahkota dewa terlampir dalam lampiran 2.

c. Metformin 850 mg yang diperdagangkan di apotek

d. Aquadestilata

e. Bahan pakan AD II dan minuman (AQUA®) selama pemeliharaan,

komposisi pakan terlampir dalam lampiran 3

f. Larutan PBS formalin 10%

g. Bahan-bahan untuk processing jaringan terdiri atas : formalin buffer,

alkohol absolut pro analize, xylol, histoplas (parafin).

h. Shandon Harris Hematoxylin kit dari Thermo Scientific ® untuk

pemeriksaan histopatologik pewarnaan Hematoxylin Eosin.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari:

1. Kandang hewan coba dengan pakan dan minum

Kandang hewan coba terbuat dari kaca sebanyak 5 buah dengan ukuran 60 x

30 x 30 cm. Kandang tersebut diberi alas berupa sekam padi dan ditutup
 35

menggunakan kawat penutup. Tempat pakan terbuat dari tempurung kelapa

atau plastik, sedangkan tempat minum terbuat dari kaca yang memiliki saluran

yang terbuat dari stainless steel.

2. Timbangan dengan skala gram

3. Spuit injeksi 3 cc

4. Spuit injeksi 1 cc

5. Sonde lambung

6. Gelas pengukur 10 c

7. Gelas pengukur 100 cc

8. Seperangkat alat bedah minor

9. Tempat penampung organ yang diawetkan

10. Seperangkat alat untuk preparasi dan pewarnaan HE

11. Mikroskop cahaya binokular dilengkapi dengan optilab®

12. Objectglass sebanyak 30 buah

13. Cover glass sebanyak 30 buah

B. Metode Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental post test only with

control group design terhadap hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) galur

Sprague dawley jantan yang diinduksi alloxan. Perlakukan terhadap hewan coba

dilakukan selama 3 minggu dan dibedakan menjadi 5 macam kelompok

perlakuan. Kelompok perlakuan hewan tersebut adalah:

 36

1. Kelompok perlakuan I, kontrol negatif yaitu kelompok normal, hanya

diberikan aquadestilata.

2. Kelompok perlakuan II, kontrol positif yaitu kelompok diabetik, tikus

diinduksi diabetes dan diberi plasebo (aquadestilata)

3. Kelompok perlakuan III, yaitu kelompok tikus diabetik yang diberi metformin

dosis 100 mg/kgBB perhari per sonde lambung

4. Kelompok perlakuan IV, yaitu kelompok tikus diabetik yang diberi ekstrak

methanol daging buah mahkota dewa dengan dosis 250 mg/kgBB perhari per

sonde lambung

5. Kelompok perlakuan V, yaitu kelompok kelompok tikus diabetik yang diberi

ekstrak air ekstrak daging buah mahkota dewa dengan dosis 250 mg/kgBB

perhari per sonde lambung.

C. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) atau Completed

Randomized Design (CRD) dengan pendekatan post-test only-with control group

menggunakan lima kelompok perlakuan terhadap hewan coba.

D. Variabel Penelitian

1. Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini berupa pemberian antidiabetik berupa:

metformin, ekstrak methanol daging buah mahkota dewa dosis 250 mg/kgBB

dan ekstrak air daging buah mahkota dewa dosis 250 mg/kgBB.
 37

2. Variabel Tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini berupa jumlah glomerulus yang

mengalami glomerulosklerosis.

E. Definisi Operasional

Untuk definisi operasional akan dijelaskan pada tabel 3.1. :

F. Cara Mengukur Variabel

Hari ke-22 perlakuan, 30 ekor tikus dikorbankan dengan cara dekapitasi,

kemudian dilakukan pengambilan jaringan ginjal. Ginjal kanan dibilas dalam

larutan garam kemudian ditimbang. Jaringan ginjal yang diambil dimasukkan

dalam tabung berisi larutan PBS formalin 10 % untuk di fiksasi. Organ ginjal

yang telah difiksasi kemudian diambil untuk dibuat preparat mikroskopis sesuai

dengan prosedur dan diwarnai dengan pewarnaaan Hematoksilin Eosin (HE).

Preparat dibuat di laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran, UGM,

Yogyakarta.

Glomerulosklerosis diukur dengan cara menghitung jumlah glomerulus

yang terdapat sklerosis dalam satu preparat sebanyak 5 lapang pandang.

 38

Tabel 3.1. Definisi operasional variabel

Variabel Definisi operasional Jenis data Skala data

Independen Aquadestilata Cairan aquadestilata yang diberikan dalam 5 cc/tikus. Diberikan Kategorik Nominal
personde kepada kelompok perlakuan setiap hari selama tiga
minggu.

Metformin Obat hipoglikemik oral golongan biguanid yang diperdagangkan di Kategorik Nominal
apotek dalam bentuk tablet 850 mg, diberikan pada kelompok
perlakuan dengan dosis 100 mg/kg berat badan, satu kali sehari per
sonde selama tiga minggu.

Ekstrak methanol Hasil ekstraksi daging buah mahkota dewa menggunakan methanol, Kategorik Nominal
daging buah diberikan pada kelompok perlakuan dengan dosis 250 mg/kg berat
mahkota dewa badan, satu kali sehari per sonde selama tiga minggu.

Ekstrak air daging Hasil ekstraksi daging buah mahkota dewa menggunakan air, Kategorik Nominal
buah mahkota diberikan pada kelompok perlakuan dengan dosis 250 mg/kg berat
dewa badan, satu kali sehari per sonde selama tiga minggu.

Dependen Jumlah glomerulus Gambaran struktur glomerulus yang mengalami perubahan Numerik Rasio
yang mengalami miroskopis berupa sklerosis yaitu adanya gambaran eosinofilik
glomerulosklerosis sehingga terlihat seperti jaringan parut didalam glomerulus dengan
pengamatan dalam 5 lapang pandang menggunakan pembesaran
400x.
 39

G. Tata Urutan Penelitan (terlampir dalam lampiran 1)

1. Persiapan hewan coba

Hewan coba ditimbang, dipilih tikus dengan berat antara 160-200 gram.

Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu kelompok I, II, III,

IV dan V sebanyak masing-masing 6 ekor. Tiap hewan coba pada kelompok

diberi nomor urut a, b, c, d, e dan f. Setelah semua hewan coba ditimbang,

dikelompokkan dalam lima kandang terpisah dan diberi label kandang 1,

kandang 2, kandang 3, kandang 4 dan kandang 5.

2. Aklimatisasi

Hewan coba diadaptasikan selama 7-12 hari sebelum penelitian dan selama

penelitian diberi asupan makanan dan air yang cukup.

3. Induksi diabetik

Hewan coba dipuasakan selama satu malam (10-12 jam), selanjutnya diinjeksi

alloksan monohidrat dengan dosis 150 mg/kg BB single dose secara

intraperitoneal (Triastuti et al., 2009). Hiperglikemia terjadi setelah 48 jam

setelah injeksi. Kadar glukosa darah puasa lebih dari 130 mg/dl yang dipilih

sebagai subyek penelitian karena sudah mengalami diabetes (Sedigheh, 2011).

Kadar glukosa darah puasa normal tikus jenis kelamin jantan galur SD adalah

105,2 ± 14,2 mg/dl (Fahri et al., 2005).

 40

3. Pembuatan Ekstrak Mahkota Dewa

Ekstrak mahkota dewa dalam bentuk ekstrak pekat menggunakan methanol

dan air (terlampir pada lampiran 2). Ekstraksi dilakukan di laboratorium

Biologi, Jurusan Farmasi, FKIK, UNSOED.

4. Perlakuan hewan coba

Masing-masing kelompok mendapat perlakuan sesuai jadwal berikut :

1) Kelompok perlakuan I, kontrol negatif yaitu kelompok normal (hanya

mendapatkan sonde aquadestilata).

2) Kelompok perlakuan II, kontrol positif yaitu kelompok DM (diinduksi

diabetogen) dan hanya mendapatkan sonde aquadestilata.

3) Kelompok perlakuan III, yaitu kelompok DM dan selanjutnya diberi

metformin dengan dosis 100 mg/kgBB perhari per sonde lambung.

4) Kelompok perlakuan IV, yaitu kelompok tikus DM yang diberi fraksi

methanol ekstrak mahkota dewa dengan dosis 250 mg/kgBB perhari per

sonde lambung.

5) Kelompok perlakuan V, yaitu kelompok kelompok tikus DM yang diberi

fraksi air ekstrak mahkota dewa dengan dosis 250 mg/kgBB perhari per

sonde lambung.

Perlakuan dilaksanakan setiap sore selama tiga minggu (21 hari) berturut-

turut. Pemeriksaan berat badan dan glukosa darah puasa dilakukan setiap

tujuh hari pada waktu yang sama. Perlakuan dilaksanakan di laboratorium

Hewan Coba, Jurusan Kedokteran, FKIK UNSOED.

 41

5. Terminasi hewan coba

Hari ke-22, hewan coba dikorbankan dengan cara dekapitasi, kemudian

dilakukan pengambilan jaringan ginjal kanan. Ginjal kanan dibilas dalam

larutan NaCl kemudian ditimbang. Jaringan ginjal yang diambil dimasukkan

dalam tabung berisi larutan PBS formalin 10 %.

6. Pembuatan preparat mikroskopis

Organ ginjal yang telah difiksasi kemudian diambil untuk dibuat preparat

mikroskopis sesuai dengan prosedur dan diwarnai dengan pewarnaaan

Hematoksilin Eosin (terlampir dalam lampiran 5). Preparat dibuat di

laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran, UGM, Yogyakarta.

7. Pengamatan mikroskopis dan dokumentasi

Dari sediaan yang ada, diamati dan dihitung bagian glomerulusnya yang

mengalami sklerosis. Penghitungan dilakukan di laboratorium Histologi,

Jurusan Kedokteran, FKIK, UNSOED.

H. Analisis Data

Pengolahan dan analisis data dilakukan dengan program komputer. Analisis

dilakukan dengan bantuan piranti lunak SPSS® 15.00 untuk Windows.

Karakteristik hewan coba ditampilkan dalam tabel yang mencantumkan rerata +

standar deviasi dan histogram distribusi frekuensi. Analisis bivariat dilakukan

untuk mengetahui beda antara kelompok perlakuan dari variabel yang diukur.

Sebelum dilakukan uji hipotesis, normalitas data diuji dengan uji Saphiro-Wilk.

Hasil uji Saphiro-Wilk menunjukkan bahwa sebaran data normal, maka uji
 42

hipotesis yang digunakan adalah one-way ANOVA yang dilanjutkan dengan uji

Post-hoc LSD untuk mengetahui kelompok mana yang berbeda secara bermakna

dengan paling tidak terdapat dua kelompok data yang mempunyai perbedaan

rerata yang bermakna, apabila data tidak normal maka dilakukan transformasi

data terlebih dahulu dan jika data masih tidak normal dilakukan uji

nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis. Uji statistik dilaksanakan dengan taraf

kepercayaan 95% (α=0,05) (Dahlan, 2009).

I. Waktu dan Tempat Penelitian

Waktu dan tempat penelitian di deskripsikan sebagai berikut:

1. Waktu Penelitian

Tanggal : Agustus – Desember 2012

2. Tempat Penelitian

a. Laboratorium Hewan Coba, Jurusan Kedokteran, FKIK, UNSOED yaitu

tempat perlakuan dilaksanakan.

b. Laboratorium Biologi, Jurusan Farmasi, FKIK, UNSOED, yaitu tempat

pembuatan ekstrak mahkota dewa.

c. Laboratorium Histologi, Jurusan Kedokteran, FKIK, UNSOED, yaitu

tempat untuk pengamatan mikroskopis.

d. Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Fakultas Biologi, UNSOED, yaitu

tempat determinasi daging buah mahkota dewa.

e. Laboratorium Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran, UGM, yaitu untuk

tempat pembuatan preparat.

 43

J. JADWAL PENELITIAN

Tabel 3. 2. Jadwal Penelitian

Kegiatan Bulan
Agustus September Oktober November Desember
Persiapan √
Pelaksanaan penelitian √ √
Analisis data hasil √ √
penelitian
Penyusunan laporan √
akhir