BAB 2

METODE PENELITIAN

2.1. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan design penelitian Post-Test Only Control Group
Design yang bertujuan untuk menilai perbedaan kadar gula darah, MDA, dan enzim katalase pada darah serta
gambaran histologi pankreas pada masing-masing kelompok tikus.
2.2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Tikus Putih (Riwandi Animal House) di Kota Medan pada Juli-
Agustus 2019.
2.3. Justifikasi Hewan Uji
Sampel hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus wistar jantan yang telah disediakan di
Laboratorium Farmasi Universitas Sumatera Utara Medan. Jumlah hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini
dihitung dengan menggunakan rumus yang dijelaskan oleh Charan dan Kantharia (2016) dengan persamaan berikut:
E = Jumlah Sampel Hewan – Jumlah Kelompok
Nilai E sebaiknya berada diantara nilai 10 – 20, sehingga dapat disimpulkan dari jumlah kelompok pada
penelitian ini agar nilai E berada diantara 10-20. Maka, Jumlah sampel hewan yang digunakan antara 15-25
ekor tikus, yang dibagi dalam 5 kelompok (Charan and Kantharia, 2013).
2.4. Prosedur Kerja
2.4.1. Persiapan bahan.
Sampel daun mangkokan (Polyscias scutellaria) yang digunakan dalam penelitian ini dikumpulkan dari
beberapa tempat di sekitaran kecamatan Medan Petisah, yang kemudian diidentifiaksi di Herbarium Medanese di
FMIPA Universitas Sumatera Utara.
2.4.2. Pembuatan Ekstrak
Sampel daun mangkokan (Polyscias scutellaria) yang telah diidentifikasi kemudian dibersihkan kemudian
diangin-anginkan selama 7 hari sampai menjadi simplisia kering, yang kemudan dihaluskan hingga menjadi serbuk
simplisia kering. Serbuk simplisia kering tersebut dimaserasi dengan menggunakan etil asetat sebagai pelarut
dengan perbandingan 1:15 (gr/ml) selama 5 hari, campuran diaduk secara rutin dan konstan setiap harinya. Setelah 5
hari, campuran tersebut disaring dengan kertas saring Whatmann no. 1, residu dimaserasi ulang dengan cara yang
sama namun pelarut yang digunakan setengah dari volume maserasi sebelumnya. Proses maserasi dilakukan
sebanyak 3 kali, kemudian filtrate dari masing-masing hasil maserasi dan maserasi ulang dievaporasi dengan rotary
evaporator pada suhu 70oC dan selanjutnya dilanjutkan dengan pengeringan menggunakan oven pada suhu 40oC
hingga menjadi ekstrak kental (NN, 2015; Eden et al., 2016; Rosa et al., 2019)
2.4.3. Skrining Fitokimia Ekstrak
Pada penelitian uji fitokimia menggunakan modifikasi cara Fansworth yang terdiri dari identifikasi fenol,
steroid/ triterpenoid, terpenoid, saponin, flavonoid, tannin dan alkaloid (Widowati et al., 2016, 2017, 2018).
2.4.4. Induksi Tikus Wistar
 Proses induksi tikus wistar jantan dilakukan dengan menggunakan Alloxan Monohydrate 10%. Sebanyak
0.35 ml (175 mg/kg BB tikus) Alloxan monohydrate 10% disuntikkan secara intraperitoneal. Untuk memastikan
induksi telah berhasil, kadar gula darah puasa setelah 72 jam, tikus dikatakan diabetes jika kadar gula darah lebih
dari 200 mg/L (11.1 mmol/L) (Njagi E N Mwaniki and Njagi J Murugi, 2015; Nair and Jacob, 2016; Ighodaro,
Adeosun and Akinloye, 2017).
2.4.5. Pengujian Aktivitas Anti-Diabetik Ekstrak
Pengujian aktivitas anti-diabetik dilakukan pada 25 ekor tikus yang dikelompokkan ke dalam 5 kelompok
perlakuan dan seluruh tikus diinduksi dengan aloksan, sebagai berikut:
Tabel 1 Kelompok Perlakuan Tikus

Kelompok Perlakuan Perlakuan

Kontrol Tikus pada kelompok ini menerima 1 ml suspensi Na-CMC 0.5%.
Makan dan Minum diberikan secara ad libitum
Standar Tikus pada kelompok ini menerima 1 ml suspensi oral metformin
250mg/KgBB. Makan dan Minum diberikan secara ad libitum
Ekstrak Dosis 125 mg/kgBB Tikus pada kelompok ini menerima 1 ml suspensi oral ekstrak dosis
125 mg/kgBB. Makan dan Minum diberikan secara ad libitum
Ekstrak Dosis 250 mg/kgBB Tikus pada kelompok ini menerima 1 ml suspensi oral ekstrak dosis
250 mg/kgBB. Makan dan Minum diberikan secara ad libitum

Ekstrak Dosis 500 mg/kgBB Tikus pada kelompok ini menerima 1 ml suspensi oral ekstrak dosis
500 mg/kgBB. Makan dan Minum diberikan secara ad libitum

2.4.6. Pengukuran Kadar Gula Darah

Kadar gula darah yang diukur dalam penelitian ini adalah kadar gula darah puasa/Fasting Plasma Glucose
(FPG). FPG diukur pada tikus yang telah dipuasakan selama 10-12 jam sebelum dilakukan pengukuran kadar gula
darah. Sampel darah dari tikus diambil dari pembuluh darah vena pada ekor tikus 72 jam setelah induksi (FPG 0)
dan pada hari ke-28 (FPG 28) setelah tikus diberikan ekstrak daun mangkokan (Polyscias scutellaria) dan
glibenklamid sebagai standar (Zubaidah et al., 2019).
2.4.7. Pengambilan Sampel Serum dan Jaringan
Sebelum tikus dibedah tius tersebut dianastesi terlebih dahulu dengan menggunakan kloroform secara
inhalasi. Setelah tikus dianastesi, tikus dibedah kemudian diambil darah tikus dengan menggunakan syringe with
needle 5 ml dari jantung (cardiac puncture), kemudian diambil organ pankreas dari tikus diambil dan dicuci dengan
larutan NaCl 0.9% untuk membersihkan dari sisa darah yang menempel.
Darah tikus digunakan untuk diambil serum darahnya dengan cara membiarkan sampel darah tikus yang
telah diambil didiamkan hingga membentuk clot pada vial steril. Serum diambil dari proses sentrifus pada kecepatan
2000 rpm selama 10 menit. Kemudian serum darah diaspirasi dan disimpan dalam pendingin pada suhu 4 oC dan siap
digunakan untuk uji parameter biokimia (Obasi et al., 2019).
 Pankreas tikus kemudian dimasukkan ke dalam larutan buffer formalin 10%. Lalu dibuat preparat dengan
ketebalan 4-6 mm, diwarnai dengan hekmatosilin dan eosin dan dilihat di bawah mikroskop. Selanjutnya organ
pankreas dipotong dengan ketebalan 4 – 6 mm. Jaringan yang telah difiksasi kemudian didehidrasi dengan alkohol
mulai dari konsentrasi 70%, 80%, 90%, 95% masing-masing selama 24 jam dilanjutkan dengan alkohol 100%
selama 1 jam yang diulang tiga kali. Setelah didehidrasi dilanjutkan dengan penjernihan dengan menggunakan xilol
sebanyak tiga kali masing-masing selama 1 jam dilanjutkan dengan infiltrasi parafin. Jaringan kemudian ditanam
dalam media parafin. Berikutnya dilakukan penyayatan dengan ketebalan 4 - 5 mikron. Hasil sayatan dilekatkan
pada kaca objek, kemudian diwarnai dengan pewarnaan hematoksilin-eosin (HE). Pemeriksaan histopatologi
dilakukan dan berdasarkan prosedur kerja yang diterapkan di laboratorium patologi anatomi Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara.
2.4.8. Pengukuran Aktifitas Katalase dan MDASerum
Pengukuran aktifitas katalase pada serum diukur dengan menggunnakan reagen katalase sesuai dengan
prosedur penelitian yang dijelaskan oleh Eslami et al. (2015), sedangkan kadar MDA serum diukur dengan prosedur
yang dijelaskan oleh Obasi et al. (2019) dengan menggunakan sampel serum darah tikus yang telah disiapkan
sebelumnya (Eslami et al., 2015; Obasi et al., 2019).
2.4.9. Analisa Data
Analisa data dilakukan dengan menggunakan IBM SPSS 25. Data berupa Rendemen ekstrak, hasil skrining
fitokimia, BB tikus, FPG 0, FGP 28, serta gambaran histopatologi dianalisa dengan statistik deskriptif. Kemudian
data BB tikus, FPG 0, dan FGP 28 dianalisa normalitas data dengan uji Shapiro-wilk. Jika data tersebut terdistribusi
normal, maka analisa dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA dan Post Hoc Test. Namun jika data terdistribusi
tidak normal, maka analisa data dilanjutkan dengan Uji non-parametrik berupa uji Kruskal-wallis.
2.5 Alur Penelitian

Pengumpulan Daun mangkokan (Polyscias

scutellaria)

Identifikasi Tanaman

Pembuatan Serbuk Simplisia

Proses Maserasi Terhadap

Simplisia

Rotary Evaporator

Skrining Fitokimia

Tikus diinduksi dengan Penelitian ini menggunakan 25

Alloxan Monohydrate ekor tikus yang dibagi dalam 5
10% ekor tikus/ kelompok.

Kontrol
Pengukuran Kadar
Fasting Plasma Ekstrak Daun mangkokan 125
Glucose (FPG) dari mg/kgBB
Vena di Ekor

Ekstrak Daun mangkokan 250

mg/kgBB

Pengukuran Kadar
Ekstrak Daun mangkokan 500
MDA, aktivitas enzim
mg/kgBB
katalase dan
histopatologi Jaringan
Standar (Metformin 250
mg/KgBB)