BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian True Experimental dengan desain

penelitian yang digunakan adalah Post Test Only Control Group Design.

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitan

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik Kampus II

Universitas Muhammadiyah Malang yang berlangsung pada bulan Januari

2017 sampai Januari 2018.

4.3 Populasi dan Sampel

4.3.1 Populasi

Populasi penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus novergicus

strain wistar)

4.3.2 Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih

jantan (Rattus novergicus strain wistar) yang sesuai dengan kriteria

inklusi.

4.3.3 Estimasi besar sampel

Estimasi besarnya replikasi yang digunakan pada penelitian ini

adalah dengan rumus (Federer, 1963)

(t-1) (p-1) ≥ 15

(t-1) (4-1) ≥ 15

(t-1) 3 ≥ 15

3t-3 ≥ 15

28
 29

3t ≥ 15 + 3

3t ≥ 18

t ≥ 18/3

t≥6

Keterangan :

t = jumlah replikasi per perlakuan

p = jumlah kelompok perlakuan

Untuk mengetahui sampel minimal yang diperlukan, digunakan

rumus (Charan, 2013) :

E = Total hewan coba – Banyak kelompok perlakuan

E = (6 x 4) – 4

E = 24 – 4

E = 20

Sampel penelitian minimal adalah 20 ekor tikus. Untuk

mengantisipasi jika terdapat tikus yang masuk dalam kriteria eksklusi

maupun drop out selama penelitian, dilakukan perhitungan

menggunakan rumus besar sampel (Aziz, 2007) sebagai berikut :

n’ = [n/1-f]

Keterangan :

n’ = Jumlah sampel penelitian

n = besar sampel yang dihitung

f = perkiraan proporsi drop out, kira-kira 10% (f = 0,1)

 30

Jumlah sampel dalam penelitian ini adalah (n’) = 6 / (1-0,1) =

6,67 = ± 7. Sehingga cadangan dalam setiap kelompok perlakuan

adalah 7-6 =1.

Total sampel dalam penelitian = sampel minimal + sampel cadangan

= 20 + (1 x 4)

= 24 ekor tikus.

Jumlah sampel dalam penelitian ini adalah 24 ekor tikus,

sehingga masing-masing kelompok perlakuan terdapat 6 ekor tikus.

4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel

Teknik pengambilan sampel dengan menggunakan purposive

sampling.

4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian

a. Kriteria inklusi

- Tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar) sehat, yang

ditandai dengan gerakan aktif dan mata yang jernih

- Umur 2-3 bulan

- Berat badan 150-250 gram

b. Kriteria eksklusi

- Tikus yang cacat (lumpuh, ada kelainan pada mata, ada luka)

sebelum perlakuan

- Tikus yang mati sebelum perlakuan

c. Kriteria drop out

- Tikus yang mati saat perlakuan

 31

4.3.6 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

4.3.6.1 Variabel Penelitian

a. Variabel bebas : ekstrak kulit apel varietas fuji (Malus

domestica)

b. Varibel terikat : jumlah sel radang PMN plantar pedis tikus

putih (Rattus novergicus strain wistar)

4.3.6.2 Definisi Operasional

a. Ekstrak kulit apel varietas fuji dalam penelitian ini adalah

ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi kulit apel

varietas Fuji (Malus domestica) dengan metode maserasi

menggunakan pelarut ethanol 70 % yang didapatkan dari

UPT Materia Medika Kota Batu. Skala data yang digunakan

adalah ordinal.

b. Jumlah sel radang PMN plantar pedis tikus putih (Rattus

novergicus strain wistar) dalam penelitian ini adalah

gambaran secara histologis yang terdiri dari sel neutrofil

dengan ciri - ciri 3-5 lobus berbentuk lonjong yang

dihubungkan dengan benang-benang kromatin halus

berwarna ungu. Eusinofil yang memiliki granula kasar dan

besar berwarna jingga kemeraham dan memiliki nukleus

dengan 2 lobus. Basofil yang bergranula besar, tidak

beraturan, berwarna keungguan hingga hitam, dan memiliki

nukleus berbentuk seperti huruf S. Pembuatan sediaan

 32

dengan pewarnaan Hematoxylin Eosin.Skala data yang

digunakan dalah rasio.

4.4 Alat dan Bahan Penelitian

Bahan utama yang dibutuhkan adalah ekstrak kulit apel varietas

fuji, tikus putih jantan strain wistar, dan karagenan. Untuk pemberian

bahan uji, dibutuhkan NaCl 0,9 %, beaker glass, pengaduk, sonde, dan

spuit injeksi. Untuk pemeliharaan tikus dibutuhkan makanan tikus

BR-1, aquadest, kandang tikus dan penutup kandang tikus dari

anyaman kawat, tempat minum tikus, timbangan tikus.

Untuk pembiusan dan pembedahan dibutuhkan kloroform, kapas,

alat bedah minor, stopwatch, papan bedah, handscoon, jarum pentul.

Untuk pembuatan sediaan jaringan dibutuhkan formalin 10 %, parafin,

xylol, alkohol 96 %, alkohol 80 %, cat Hematoxylin, cat pembanding

Eosin, amonia cair, label, botol film 26 buah untuk menyimpan

potongan subplantar pedis, rotary evaporator, mikroskop cahaya,

slide glass 20 buah, kaset preparat, mesin tissue tax processor, dan

mesin microtome.

4.5 Prosedur Penelitian

4.5.1 Aklimatisasi

Aklitimasi hewan coba dalam kandang diletakkan di

tempat pemeliharaan tikus Laboratotium Biomedik Fakultas

Kedokteran Muhammadiyah Malang kampus II selama 7 hari

dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan

baru. Dalam proses ini tikus diberi makan pellet (BR-1 30

 33

gram/ekor) dan diberi air minum sebelum diberi perlakuan

sambil diamati kesehatannya.

4.5.2 Pembuatan Ekstrak Kulit Apel

Pembuatan ekstrak kulit apel menggunakan metode

maserasi dengan cara:

1. Kulit apel yang sudah dikeringkan dihaluskan dengan

blender sehingga diperoleh bentuk bubuk.

2. Bubuk kulit apel dibungkus dengan kertas saring dan

dimasukkan kedalam gelas ekstraksi.

3. Tambahkan pelarut etanol 70% sampai dapat merendam

bahan dan ditutup selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan

penyaringan bahan dengan kain saring sampai tidak ada

cairan yang menetes dari bahan, kemudian pindahkan hasil

penyaringan pada labu evaporator.

4. Lakukan destilasi pada suhu titik didih etanol (78,320C)

sampai tertinggal cairan pekat pada labu evaporator, dan

tunggu hingga dingin.

5. Hasil evaporasi ditampung dalam cawan penguap kemudian

di oven selama 2 jam pada suhu 80C (sesuai titik didih

etanol) untuk menguapkan pelarut yang tersisa, sehingga

didapatkan hasil ekstrak kulit apel 100%

6. Ekstrak kemudian ditimbang menggunakan neraca analitik.

 34

4.5.3 Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Apel

Pada penelitian sebelumnya ekstrak kulit apel yang dibuat

dari beberapa varietas apel yaitu 80% McIntosh, dan 20%

Northern Spy blend, Cortland, Empire, Idared, Jonagold, dan

Spartan memiliki kandungan polyphenol sebesar 1410 mg, dari

ekstrak tersebut kemudian dilakukan penelitian pada tikus

sebagai pencegahan dan penanganan pada inflammatory Bowel

Disease (IBD). Dosis yang digunakan pada penelitian tersebut

adalah sebesar 200-400 mg/kgBB/hari (Denis et al., 2016)

Berdasarkan penelitian tersebut dapat dibuat perbandingan

untuk menentukan dosis ektrak kulit apel Fuji yang memiliki

kandungan polyphenol sebesar 577,99 mg dengan perhitungan

sebagai berikut:

1410 𝑚𝑔 𝑥
𝐷𝑜𝑠𝑖𝑠 = =
577,99 𝑚𝑔 400 𝑚𝑔/𝑘𝑔

564000 = 577,99 x

x = 975 mg/kg

Dosis yang didapat dijadikan sebagai dosis II, dan

dilakukan modifikasi pada dosis yang lainnya yaitu 487 mg/kg

sebagai dosis I dan 1950 mg/kg sebagai dosis III

4.5.4 Pembuatan Bahan Penginduksi Inflamasi

Karagenan yang digunakan adakah karagenan kappa.

Ekstrak karagenan sebanyak 100 mg karagenan ditimbang

seksama dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml, kemudian

 35

ditambahkan dengan NaCl 0.9% sampai garis tanda 10 ml pada

gelas ukur kemudian dikocok.

4.5.5 Pembagian Kelompok Penelitian

Pada penelitian ini terdapat 4 kelompok penelitian yang

terdiri dari :

1. Kelompok 1 : Kontrol positif (diberi induksi inflamasi

karagenan 1 % plantar pedis)

2. Kelompok 2 : Kelompok perlakuan 1 (diberi induksi

inflamasi karagenan 1 % plantar pedis dan ekstrak kulit

apel 487 mg/kg BB tikus)

3. Kelompok 3 : Kelompok perlakuan 2 (diberi induksi

inflamasi karagenan 1 % plantar pedis dan ekstrak kulit

apel 975 mg/kg BB tikus)

4. Kelompok 4 : Kelompok perlakuan 3 (diberi induksi

inflamasi karagenan 1 % plantar pedis dan ekstrak kulit

apel 1950 mg/kg BB tikus)

4.5.6 Prosedur Euthanasia Hewan Coba

Proses anestesi dilakukan dengan memasukkan hewan

coba ke dalam toples kaca yang berisi kapas yang sudah

dicampur dengan kloroform. Anestesi dilakukan secara inhalasi

pada hewan coba dengan dosis 0,67 ml/hewan coba selama ±

60 detik yang dihitung dengan menggunakan stopwatch.

4.5.7 Prosedur Pembuatan Sediaan Histopatologi

1. Prosedur pemotongan jaringan makros kaki tikus

 36

a. Potong jaringan dengan scalpel dengan tebal ± 2-3 mm

b. Masukkan jaringan ke Tissue Cassette sesuai dengan

kode sampel 1,2,3, dst.

c. Lakukan fiksasi dengan Buffered Neutral Formalin

(BNF) 10 %

d. Proses dehidrasi menggunakan mesin Tissue Tax

Processor

2. Proses pengeblokan dan pemotongan jaringan

a. Jaringan diangkat dari mesin Tissue Tax Processor dan

disimpan pada temperature 60oC untuk sementara

waktu

b. Jaringan diblok dengan parafin sehingga terendam

seluruhnya

c. Potong jaringan dengan mesin microtome ketebalan 3-5

mikron

3. Proses deparafinisasi

Setelah dipotong sesuai ketebalan, kemudian

jaringan di oven selama 15 menit dengan suhu 70oC ,

setelah itu dimasukkan ke dalam larutan xylol masing-

masing 15 menit dengan suhu xylol 70oC

4. Pewarnaan Sel Radang (PMN)

Preparat diletakkan pada rak khusus dan secara

berurutan dilakukan :

a. Siapkan 4 tabung alkohol 96 %

 37

b. Celupkan preparat ke dalam masing-masing tabung

alkohol selama 3 menit

c. Bilas dengan air mengalir selama 10 menit

d. Pengecatan dengan cat utama Hematoxylin Eosin selama

10 menit

e. Bilas dengan air mengalir selama 15 menit

f. Celupkan preparat ke dalam alkohol 1 % sebanyak 2-5

kali

g. Celupkan kembali ke dalam air amonia sebanyak 3-5 kali

h. Celupkan pada cat pembanding eosin 1 % selama 15

menit

i. Proses dehidrasi, celupkan berurutan pada :

- Alkohol 80 % selama 3 menit

- Alkohol 96 % selama 3 menit

- Alkohol 96 % pada tabung lain selama 3 menit

j. Proses penjernihan, celupkan berurutan pada :

- Xylol selama 15 menit

- Xylol pada tabung lain selama 15 menit

k. Preparat diangkat dalam keadaan basah dari larutan xylol

dilakukan mounting dan tutup dengan deck glass

l. Keringkan dan simpan pada wadah preparat

 38

4.5.8 Pengukuran Jumlah Sel PMN

Menghitung jumlah sel neutrofil pada sediaan

histopatologis menggunakan mikroskop cahaya dengan

perbesaran 400 x, dalam 5 lapangan pandang.

4.5.9 Perlakuan Terhadap Hewan Coba Setelah Perlakuan

Setelah dilakukan perlakuan, tikus dimatikan dengan

cervical dislocation hingga mati, kemudian hewan coba akan

dikuburkan dengan cara (INSA, 2000 ; SEPA, 2009) :

1. Tikus dibungkus dengan polibag

2. Tikus dimasukkan kedalam lubang pada tanah yang kering

dengan kedalaman lubang pada tanah yang kering dengan

kedalaman 1 meter dan dengan jarak minimal 250 meter dari

sumber air

3. Masing-masing lubang berisi tidak lebih dari 10 ekor tikus.

4.5.10 Tahap Perlakuan

1. Tikus diadaptasikan di dalam kandang selama 1 minggu,

diberi pakan berupa BR-1 dan air minum

2. Tikus dipuasakan ± 8 jam sebelum perlakuan, air minum

tetap diberikan

3. Pada hari pengujian, ditimbang bobotnya dan dikelompokkan

secara random

4. Pada plantar pedis kiri masing-masing tikus disuntik secara

intraplantar dengan suspense karagenan 1 % sebanyak 0,1 ml.

5. Setelah 2 jam, diberikan bahan uji secara per oral

 39

a. Kelompok kontrol positif tanpa diberikan bahan uji

b.Kelompok uji ekstrak kulit apel 487 mg/ kg BB tikus

c.Kelompok uji ekstrak kulit apel 975 mg/ kg BB tikus

d.Kelompok uji ekstrak kulit apel 1950 mg/ kg BB tikus

6. Pada waktu 6 jam, tikus dianestesi dengan 0,67 ml kloroform

secara inhalasi

7.Pengambilan jaringan subplantar dan pembuatan sediaan

histopatologi.

8. Perhitungan jumlah sel radang PMN plantar pedis tikus

9. Perlakuan tikus setelah penelitian dan penguburan tikus.

10.Analisa data dengan SPSS

 40

4.6 Alur Penelitian

Pengumpulan tikus Rattus novergicus strain wistar

Aklimatisasi 24 ekor tikus baik pakan dan lingkungan selama 1 minggu

Pembagian kelompok perlakuan

Tikus dipuasakan selama 8 jam

Kontrol Positif Kelompok P 1 Kelompok P 2 Kelompok P 3

Diberi pakan Diberi pakan Diberi pakan Diberi pakan

standar BR-1 standar BR-1 standar BR-1 dan standar BR-1
dan air minum dan air minum air minum dan air minum
aquadest aquadest aquadest aquadest

Induksi Induksi Induksi Induksi

karagenan 0,1 karagenan 0,1 karagenan 0,1 ml karagenan 0,1 ml
ml personde ml personde personde personde

Ekstrak kulit Ekstrak kulit Ekstrak kulit apel

apel (Malus apel (Malus (Malus
domestica) 487 domestica) 975 domestica) 1950
mg/kg BB tikus mg/kg BB tikus mg/kg BB tikus
personde personde personde

Setiap tikus di anestesi dengan kloroform secara inhalasi

Pengambilan jaringan dan pembuatan sediaan histopatologi

Penghitungan jumlah sel PMN pada mikroskop

Perlakuan tikus setelah penelitian

Analisa data

Gambar 4.1
Alur Penelitian
 41

4.7 Metode Analisis Data

Dari hasil penelitian akan dilakukan uji distribusi data menggunakan uji

Shapiro-Wilk. Apabila hasil p>0,05 dikatakan data memiliki distribusi normal.

Selanjutnya dilakukan uji variasi data atau homogenitas dengan menggunakan

Uji Levene. Dikatakan homogen apabila p>0,05. Jika distribusi data normal

dan data homogen, maka dilakukan uji One Way Anova untuk menguji

perbedaan antar seluruh kelompok perlakuan. Dan untuk mengetahui

perbedaan masing-masing kelompok perlakuan digunakan Post Hoc Test

dengan menggunakan uji Bonferroni bila hasil variasi data homogen, dan

Tamhane’s bila hasil variasi data tidak homogen. Selanjutnya dilakukan uji

Regresi Linier untuk mengetahui besarnya pengaruh dan memprediksi

pengaruh dosis ekstrak kulit apel dengan sel radang PMN pada subplantar

tikus. Semua analisis statistik data tersebut dilakukan menggunakan SPSS

versi23.