BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini adalah true experimental labroratory dengan rancangan posttest

only control group design. (Hidayat, 2011)

B. Tempat dan Waktu Penelitian

1. Tempat Penelitian

a. Determinasi buah delima merah (Punica granatum L.) akan dilakukan di

laboratorium Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah

Surakarta.

b. Tempat pembuatan ekstrak etanol buah delima (Punica granatum L.) dan tempat

penelitian pengaruh ekstrak etanol buah delima (Punica granatum L.) terhadap penyembuhan

luka bakar pada tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur wistar akan dilakukan di

Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Surakarta.

2. Waktu Penelitian

Waktu penelitian direncanakan akan di lakukan Januari 2019

C. Identifikasi Variabel Penelitian

1. Variabel Pengaruh

Ekstrak biji delima (Punica granatum L.) konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40% dan 80%.

34
 35

2. Variabel Terpengaruh

Peningkatan jumlah fibroblast dalam proses penyembuhan luka tikus putih jantan

(Rattus norvegicus) galur wistar.

3. Variabel Terkendali :

1) Galur tikus : Wistar

2) Jenis kelamin tikus : Jantan

3) Berat tikus: 150 – 200 gram.

4) Usia tikus : 2 – 3 bulan

5) Makanan tikus: Br 1 (Convite) : 2 x sehari

6) Jenis luka: biopsy

7) Ukuran luka pada tikus dengan diameter 3 mm kedalaman 2 mm

8) Area luka pada kanan punggung tikus

9) Konsentrasi ekstrak biji delima 5%, 10%, 20%, 40% dan 80%.

10) Cara aplikasi ekstrak biji delima : ekstrak biji delima diaplikasikan pada

gelatine sponge lalu ditempelkan menggunakan plester medis

11) aplikasi ekstrak biji delima + gelatine sponge : hanya dilakukan pada hari

pertama
 36

D. Definisi Operasional

1. Ekstrak Biji Delima (Punica granatum L.)

Ekstrak Biji delima (Punica granatum L.) adalah suatu sediaan pekat hasil penguapan

serbuk biji delima yang terlebih dahulu dikeringkan dan dimaserasi dengan pelarut etanol

70%.

2. Peningkatan jumlah fibroblast

Peningkatan Jumlah fibroblast yang dihasilkan oleh pemberian ekstrak biji delima

(Punica granatum L.) pada gelatine sponge. Diukur pada hari ke 8 dengan pengamatan

Histologi yang telah diukur menggunakan aplikasi Image J yang telah dirata rata untuk

masing-masing kelompok

E. Subjek dan Objek Penelitian

1. Pengelompokkan Subjek

Subjek penelitian ini adalah ekstrak etanol biji delima (Punica granatum L.) dengan

konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40% dan 80 % ditambah gelatine sponge. Subjek penelitian ini

adalah ekstrak etanol biji delima (Punica granatum L.) dengan konsentrasi yang berbeda

yaitu 5%, 10%, 20%, 40%, 80%. Konsentrasi pengenceran dapat diperoleh dengan rumus

Progresi Geometris (Harmita dan Radji, 2004), dengan rumus :

Y N =Y 1 R N−1
Keterangan :

Y N =dosis ke−n

Y 1=dosis pertama

R=faktor geometris ( R=2 )

N = deret dosis
 37

Penelitian ini memerlukan 5 konsentrasi, sehingga perhitungan yang diperoleh yaitu:

1) Konsentrasi Y 1

Y N =Y 1 R N−1

Y 1=5 % x 21−1

Y 1=5 % x 20

Y 1=5 % x 1

Y 1=5 %

2) Konsentrasi Y 2

Y 2=5 % x 22−1

Y 2=5 % x 21

Y 2=5 % x 2

Y 2=10 %

3) Konsentrasi Y 3

Y 3=5 % x 23−1

Y 3=5 % x 22

Y 3=5 % x 4

Y 3=20 %

4) Konsentrasi Y 4

Y 4 =5 % x 24−1

Y 4 =5 % x 23

Y 4 =5 % x 8

Y 4 =40 %

5) Konsentrasi Y 5
 38

Y 5=5 % x 25−1

Y 5=5 % x 24

Y 5=5 % x 16

Y 5=80 %

2. Pengelompokkan Objek

Objek penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus) galur wistar yang

berusia antara 2-3 bulan dengan kisaran berat antara 150-200 gram.

F. Besar Sampel

Pada penelitian ini jumlah replikasi diperoleh menggunakan Rumus Replikasi Federer

1977 (Candrasari et al., 2012).

(t-1) (r-1) ≥ 15

Keterangan: t : Jumlah kelompok sampel

r : Jumlah replikasi tiap kelompok

Berdasarkan rumus tersebut, maka prediksi besar sampel pada penelitian ini adalah :

(t-1) (r-1) ≥15

(6-1) (r-1) ≥15

5 (r-1) ≥15

(r-1) ≥3

r ≥ 4 replikasi
 39

Hasil yang didapat dari rumus Federer diatas adalah 4 replikasi sehingga pelu

dilakukan 4 pengulangan atau replikasi pada tiap kelompok. Oleh karena itu besar sample

ditentukan dari jumlah kelompok sampel dikalikan dengan jumlah repilkasi yaitu 4x6 = 24

ekor.

G. Alat dan Bahan Penelitian

Alat dan bahan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Alat Penelitian

a. Alat Utama

1) Instrumen Kedokteran Gigi Stainless (kaca mulut) (Dentica, Pakistan)

2) Jangka sorong (QTR, Japan)

3) Stopwatch (Diamond, China)

4) Spuit tetes (Terumo, Germany)

5) Punch biopsy

b. Alat Penunjang

1) Panci maserasi stainless (General, Indonesia)

2) Alat rotary evaporator (ZZKD, China)

3) Kertas saring (General, Indonesia)

4) Oven (Maspion, Indonesia)

5) Timbangan digital/Neraca ohaus (Adventurer, USA)

 40

6) Kain flanel (General, Indonesia)

7) Corong buchner (Pyrex, Japan)

8) Batang pengaduk/stirer (General, Indonesia)

9) Botol bening kecil steril (General, Indonesia)

10) Jas lab (General, Indonesia)

11) Handscoon (Sensiglove, Germany)

12) Masker (General, Indonesia)

2. Bahan penelitian

a. Bahan Utama

1) Tikus putih jantan (Rattus norveigicus) galur wistar

2) Ekstrak etanol buah delima merah (Punica granatum L.)

3) Gelatine sponge

b. Bahan Penunjang

1) Aquades steril

2) Spirtus

3) Anastesi inhalasi eter

4) Makanan tikus Br 1 (Convite)

H. Prosedur Penelitian
 41

1. Ethical Clearence

Pembuatan Ethical Clearence akan diajukan ke Komisi Etika Penelitian Kesehatan

Rumah Sakit Umum Daerah Dr. Moewardi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

Surakarta.

2. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman delima merah (Punica granatum L.) telah dilakukan di

Laboratorium Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Muhammadiyah

Surakarta

3. Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Delima Merah (Punica granatum L.)

a. Buah delima merah sebanyak 3 kg dicuci bersih dengan air mengalir, kemudian dikupas

untuk memisahkan kulit, daging dan biji buahnya dan diambil daging buahnya

b. biji dikeringkan pada suhu 400 C selama kurang lebih 24 jam di dalam oven, kemudian biji

delima merah dibuat serbuk dengan cara dihancurkan atau digiling dengan blender, sehingga

menjadi serbuk atau simplisia.

c. Kemudian simplisia biji delima merah ditimbang dengan neraca timbangan sebelum

dilakukan proses maserasi.

d. Proses maserasi dilakukan dengan cara merendam simplisia biji delima merah dalam

pelarut etanol 70% di dalam panci maserasi selama kurang lebih 30 menit dan disimpan

kedalam sebuah botol gelap selama 5 hari pada suhu kamar.

e. Setelah 5 hari, Hasil maserasi disaring menggunakan kertas saring lalu diuapkan dengan

alat vacuum rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari 50 derajat Celcius hingga pelarut

etanol 70% terpisah dari ekstrak biji delima merah

 42

f. Ekstrak etanol biji delima merah yang diperoleh dimasukkan ke dalam wadah atau botol

steril dan dibagi sesuai dengan konsentrasi ekstrak buah delima sebanyak 5%, 10%, 20%,

40% dan 80%, kemudian disimpan pada suhu 40 C sebelum digunakan.

4. Pengenceran Esktrak Etanol Biji Delima Merah

Rumus Pengenceran : (Putra et al., 2015)

V1.M1 = V2.M2

Keterangan :

V1 : Volume larutan sebelum diencerkan

M1 : Konsentrasi larutan sebelum diencerkan

V2 : Volume larutan setelah diencerkan

M2 : Konsentrasi larutan setelah diencerkan

1 gram = 1 ml

a. Esktrak pekat diambil sebanyak 2,5 gram kemudian ditambahkan aquades sebanyak 50 ml

dan diaduk hingga homogen untuk mendapatkan ekstrak etanol biji delima konsentrasi 5%

sebanyak 50 ml.

b. Esktrak pekat diambil sebanyak 5 gram kemudian ditambahkan aquades sebanyak 40 ml

dan diaduk hingga homogen untuk mendapatkan ekstrak etanol biji delima merah konsentrasi

10% sebanyak 50 ml.

c. Esktrak pekat diambil sebanyak 10 gram kemudian ditambahkan aquades sebanyak 50 ml

dan diaduk hingga homogen untuk mendapatkan ekstrak etanol biji delima merah konsentrasi

20% sebanyak 50 ml.

 43

d. Esktrak pekat diambil sebanyak 20 gram kemudian ditambahkan aquades sebanyak 50 ml

dan diaduk hingga homogen untuk mendapatkan ekstrak etanol biji delima merah konsentrasi

40% sebanyak 50 ml.

e. Esktrak pekat diambil sebanyak 40 gram kemudian ditambahkan aquades sebanyak 50 ml

dan diaduk hingga homogen untuk mendapatkan ekstrak etanol biji delima merah konsentrasi

80% sebanyak 50 ml.

Ekstrak etanol biji delima merah dengan konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40% dan 80%

didapatkan volume masing-masing sebanyak 50 ml

Pengukuran dilakukan menggunakan timbangan neraca ohaus yang memiliki satuan

pengukuran berupa gram yaitu 1 gram = 1 ml.

5. Persiapan Hewan Uji

Tikus yang digunakan yaitu 24 ekor tikus putih jantan galur wistar yang berumur 2-3

bulan dengan berat sekitar 150-200 gram. Tikus wistar diambil dan diberi nomor, kemudian

dibagi kedalam 6 kelompok perlakuan. Tiap-tiap kelompok terdiri atas 4 ekor tikus. Adapun

langkah-langkah persiapan pada tikus adalah sebagai berikut :

a. Tikus dimasukkan ke dalam wadah/baskom plastik yang dasarnya telah diberikan

alas kertas dan disimpan aman di dalam kandang selama 3 hari untuk adaptasi. Penempatan

tikus pada wadah plastik, diletakkan sesuai dengan kelompok perlakuan masing masing.

b. Kemudian tikus diberi perlakuan sesuai dengan kelompok perlakuan yang telah

ditentukan, sebagai berikut:

1) Kelompok A : Kontrol negatif dengan Gelatine sponge

 44

2) Kelompok B : Ekstrak biji delima merah konsentrasi 5% (50 ml) + Gelatine

sponge

3) Kelompok C : Ekstrak biji delima merah konsentrasi 10% (50 ml) + Gelatine

sponge

4) Kelompok D : Ekstrak biji delima merah konsentrasi 20% (50 ml) + Gelatine

sponge

5) Kelompok E : Ekstrak biji delima merah konsentrasi 40% (50 ml) + Gelatine

sponge

6) Kelompok F : Ekstrak biji delima merah konsentrasi 80% (50 ml) + Gelatine

sponge

c. Setelah beradaptasi selama 3 hari, sebelum dilakukan perlukaan semua tikus putih

wistar dianastesi secara inhalasi mengunakan eter agar tikus tidak merasakan sakit yang hebat

saat dilakukan perlukaan.

d. Luka dibuat menggunakan punch biopsy denga ukuran diamerter 4 mm dengan

kedalaman 2 mmkemudian diaplikasikan pada punggung tikus yang telah terpengaruh

anastesi inhalasi, kemudian akan terbentuk luka.

6. Perlakuan Penelitian

Semua tikus diberi perlakuan sesuai dengan kelompok perlakuan masing masing. Tiap

- tiap kelompok di lakukan pengecekan dan pemberian makan pada pagi hari pukul 08.00 dan

sore hari pada pukul 16.00

a. Hari Ke-0 : Melakukan anastesi pada tikus menggunakan inhalan eter selama 60

detik, kemudian membuat luka dengan menggunakan Punch biopsy dan diaplikasikan pada
 45

bibir kanan atas tikus wistar. Melakukan perawatan pada luka sesuai dengan kelompok

perlakuan masing-masing.

b. Hari Pertama : Melakukan pemberian makan dan pengecekan

c. Hari Kedua : Melakukan pemberian makan dan pengecekan

d. Hari Ketiga : Melakukan pemberian makan dan pengecekan

e. Hari Keempat : Melakukan pemberian makan dan pengecekan

f. Hari Kelima : Melakukan pemberian makan dan pengecekan

g. Hari Keenam : Melakukan pemberian makan dan pengecekan

h. Hari ketujuh : Melakukan pemberian makan dan pengecekan

i. Hari Kedelapan: Melakukan terminasi dan pembuatan preparat histologi

7. Pembuatan Preparat Histologis

a. Jaringan luka dan sekitarnya yang sudah difiksasi formalin 10% selama 24 jam

dipotong menggunakan skalpel bedah dengan ketebalan 4 mm.

b. Kandungan air yang ada dalam jaringan dikeluarkan menggunakan automatic tissue

processor.

c. Melakukan tahapan dehidrasi dengan alkohol 70% hingga 100% secara bertahap untuk

menghilangkan sisa-sisa jaringan pada proses fiksasi.

d. Melakukan clearing xylol untuk membersihkan sisa alkohol.

e. Melakukan penanaman jaringan pada base mold, lalu diisi blok parafin cair dengan

suhu 57oC.
 46

f. Mendinginkan cetakan blok parafin yang sudah dibuat di dalam freezer/lemari

pendingin agar tidak terlalu lunak.

g. Setelah blok parafin mengeras dapat dilakukan pemotongan/slicing menggunakan

mikrotom dengan ketebalan 3-4 μm.

h. Hasil potongan yang tipis tersebut dimasukkan ke dalam air dan ditempatkan pada

slide.

i. Setelah itu melakukan inkubasi untuk menguapkan air menggunakan hot plate selama

15 menit.

j. Slide yang sudah diinkubasi diberi pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE), setelah

jaringan terwarnai maka dilakukan proses mounting menggunakan cairan DPX.

k. Menutup slide dengan desk glass dan memberi label pada masing-masing sampel

preparat.

8. Pengamatan Histologi Jumlah Fibroblast

Preparat histologi diamati di bawah mikroskop cahaya binokuler dengan perbesaran

100 kali untuk memperjelas bentukan fibroblast. Lalu lakukan pemotretan selanjutnya bagi

foto menjadi tiga lapang pandang. Kemudian foto dilakukan penhitungan dengan aplikasi

Image J. Pengamatan jumlah fibroblas dihitung pada gambaran yang bewarna ungu pucat

berbentuk lonjong. Hasil dari stiap kelompok lalu di rata-rata sehingga didapatkan rata rata

untuk masing masing kelompok.

9. Pengumpulan Data

Pengumpulan data didapatkan dari hasil pengamatan histologis jumlah fibroblast.

 47

I. Analisis Data

Data hasil penelitian diolah secara statistik menggunakan software SPSS (Statistical Product

Service Solution) 22.0 untuk windows. Data yang diperoleh, dilakukan uji normalitas

menggunakan Shapiro-wilk test dan uji homogenitas menggunakan Levene’s test dengan nilai

kemaknaan (p)>0,05. Data telah berdistribusi normal dan homogen, maka dapat dilakukan uji

parametrik One Way Anova dengan taraf kepercayaan 95% (p<0,05) untuk mengetahui

adanya pengaruh pemberian ekstrak etanol buah delima pada gelatine sponge terhadap

peningkatan jumlah fibroblast pada proses penyembuhan luka bakar tikus wistar pada seluruh

kelompok perlakuan. Data selanjutnya dilakukan uji Post Hoc dengan analisis LSD (Least

Significant Different) untuk mengetahui perbedaan yang signifikan antar kelompok

perlakuan.
 48

J. Alur Penelitian

Hewan Uji 24 ekor tikus jantan

putih, bobot 150 - 200

Anastesi

Pembuatan Luka pada bibir kanan atas dengan

lebar 3 mm dengan kedalaman 2 mm

K (-) P (5%) P (10%) P (20%) P (40%) P (80%)

Kontrol negatif dengan Kelompok konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40% dan
pemberian gelatine 80% yang akan ditambahkan pada gelatine
spons (4 ekor) sponge setiap perlakuan 4 ekor

Perlakuan dan pengamatan

selama 7 hari

Pengumpulan data

Analisis data
 49

K. Jadwal Penelitian

WAKTU PENELITIAN 2018

JENIS KEGIATAN NOVEMBER DESEMBER JANUARI FEBRUARI
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Tahap Awal :
- Ethical Clearance
- Determinasi tanaman
- Penyediaan bahan
penelitian
Tahap Pelaksanaan :
- Pengekstrakan biji
delima merah
- Pembuatan konsentrasi
ekstrak etanol biji
delima merah
- Pembuatan luka pada
punggung tikus dengan
punch biopsy
- Pemberian perlakuan
pada tikus
- Pembuatan preparat
histologis
- Penghitungan jumlah
fibroblast
Tahap Akhir :
- Analisis data
- Penyusunan data