BAB 4

METODE PENELITIAN
4.1. Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah penelitian eksperimental
laboratoris (Notoatmodjo, 2002).
4.2. Rancangan Penelitian
Pengukuran variabel dilakukan setelah ada perlakuan dan pengambilan sampel
dilakukan secara acak dan ada kelompok kontrol atau pembanding. Oleh karena itu,
rancangan penelitian ini yang dipergunakan adalah Randomized Post Test Only Control
Group Design (Sevilla et al.,1993; Tjokronegoro dkk, 1999).

SR KAP1
KBP2
KCP3
KDP4
Keterangan :
S = sampel
R = randominasi
K A = kelompok perlakuan ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) konsentrasi 2 %
K B = kelompok perlakuan ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) konsentrasi 4 %
K C = kelompok perlakuan ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) konsentrasi 8 %
K D = kelompok kontrol negatif
P1-4 = pengamatan hari setelah perlakuan

4.3. Sampel Penelitian

4.3.1 Jenis Sampel Penelitian
Sampel penelitian ini adalah hewan percobaan berupa tikus Wistar jantan (Rattus
norvegicus). (Astuti,2011)
4.3.2 Kriteria sampel penelitian
Kriteria sampel penelitian yang digunakan yaitu:
a.

Jenis kelamin jantan

b.

Berat badan 150 160 gram c

c.

Usia 2-3 bulan

d.

Keadaan umum tikus baik

e.

Diadaptasikan 7 hari

4.3.4 Jumlah Sampel Penelitian Jumlah

Sampel penelitian yang digunakan ini adalah 24 ekor tikus Wistar jantan yang dibagi
2 kelompok secara acak dengan jumlah masing-masing kelompok adalah 12 ekor. Besar
sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah berdasarkan rumus sebagai berikut
dari Daniel (2005), yaitu :

Jadi,

jumlah

sampel minimum
yang

harus

digunakan adalah
4

sampel

masing-

untuk
masing

kelompok. Penelitian ini menggunakan 24 ekor tikus sebagai sampel, yang terbagi
kedalam 2 kelompok yang masing-masing terdiri dari 12 ekor tikus.
4.4. Variabel Penelitian
4.4.1. Variabel Bebas

Ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) konsentrasi 2 %, 4% dan 8 %

4.4.2. Variabel Tergantung
Jumlah monosit
4.4.3. Variabel Terkendali
Cara pemberian ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) Isolated Kalimantan
Tengah, berat badan hewan coba, teknik perlakuan, pembuatan ulcer
4.5. Definisi Operasional
a.

Rumput teki (Cyperus Rotundus) adalah tumbuhan tumbuh liar di tempat terbuka
atau sedikit terlindung dari sinar matahari pada lapangan rumput, pinggir jalan,
tegalan, atau lahan pertanian yang tumbuh sebagai gulma yang sukar diberantas.
Tumbuhan ini mempunyai tinggi sekitar 15-95 cm, batang segitiga. Daun 4-10 helai
terdapat pada pangkal batang membentuk roset akar, dengan pelepah daun tertutup
tanah. Helaian daun bangun pita, pertulangan daun sejajar, tepi daun rata, permukaan
atas berwarna hijau mengkilap dengan panjang 10-60 cm, dan lebar 2-6 mm.
Perbungaan majemuk berbentuk bulir mempunyai 8-25 bunga yang berkumpul
berbentuk payung, berwarna kuning atau cokelat kuning. Umbi menjalar, berbentuk
kerucut yang besar pada pangkalnya, kadang-kadang melekuk, berwarna cokelat,
berambut halus berwarna cokelat atau cokelat kehitaman, keras, wangi dan panjang
1,5-4,5 cm dengan diameter 5-10 mm (Dalimartha, 2009). Tanaman ini biasanya
tumbuh liar di kebun, ladang ataupun tempat lain dengan ketinggian sampai 1000 m
dari permukaan laut

b.

Jumlah Monosit adalah sel leukosit yang besar 3-8% dari jumlah leukosit normal,
diameter 9-10 um tapi pada sediaan darah kering diameter mencapai 20um, atau
lebih. Inti biasanya eksentris, adanya lekukan yang dalam berbentuk tapal kuda

c.

Ulkus Traumatik adalah suatu kelainan yang berbentuk ulkus pada mukosa rongga
mulut yang disebabkan oleh paparan trauma

d.

Tanah Gambut adalah tanah yang memiliki lapisan tanah kaya bahan organik (Corganik > 18%) dengan ketebalan 50 cm atau lebih. Bahan organik penyusun tanah
gambut terbentuk dari sisa-sisa tanaman yang belum melapuk sempurna karena
kondisi lingkungan jenuh air dan miskin hara

4.6. Lokasi Dan Waktu Penelitian

4.6.1. Lokasi Penelitian
a.

Pembuatan ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) dan uji kandungan ekstrak
akar rumput teki (Cyperus Rotundus) di lakukan di laboratorium Penelitian dan
Konsultasi Industri Surabaya

b.

Pemeliharaan hewan coba dan pengujian ekstrak akar rumput teki (Cyperus
Rotundus) pada hewan coba dilakukan di laboratorium Biokimia Fakultas
Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya

c.

Pembuatan sediaan dan pengamatan sediaan histometri dilakukan di laboratorium

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

4.6.2. Waktu Penelitian

Pengumpulan sampel, pemebrian perlakuan sampel, pembuatan sediaan histopatologi
serta analisis data dimulai sejak bulan September 2015 sampai dengan Desember 2015
4.7. Alat Penelitian
a.

Kandang hewan coba berukuran 60x65x80 cm

b.

Autoclave

c.

Stirer

d.

Gelas ukur

e.

Burnisher

f.

Timbangan

g.

Termometer

h.

Vibrator

i.

Tabung reaksi dan rak

j.

Pengaduk kaca

k.

Becker glass

l.

Pipet

m. Sarung tangan
n.

Kaca mulut

o.

Oven

p.

Lampu

q.

Disposible syringe 2,5 ml

r.

Penutup mulut

s.

Botol tempat sampel

t.

Label, slide dan cover glass

u.

Petri disk

v.

Burner

w. Pingset kedokteran gigi

x.

Eskavotor

y.

Mikroskop cahaya

4.8. Bahan Penelitian

a.

Akar rumput teki (Cyperus Rotoundus), diperoleh dari Provinsi kalimantan Tengah
yang hidup ditanah Gambut, dengan berat dengan dosis 500mg/kg BB untuk manusia
70 kg.

b.

Cotton buds

c.

Paraffin

d.

Xylol

e.

Aquadest

f.

Eter

g.

Buffer formalin

h.

Etanol 5%

4.9. Konversi Perhitungan dosis

Perhitungan :
Konversi dosis manusia (70kg) ke tikus (200gr) = 0,018
Dosis Ekstrak Akar Rumput Teki (Cyperus Rtundus)= 500 mg/kg BB
Dosis pada tikus = dosis terapi manusia x 0,018
= 500 mg x 0,018

= 9 mg/200 gr BB
= 0,045 mg/gr BB
Jadi dosis Ekstrak akar teki (Cyperus Rotundus) yang diberikan kepada Tikus Wistar
jantan adalah 0,045 mg/gr BB (Rehman, 2007)
4.9. Prosedur Penelitian
4.9.1. Persiapan Hewan Coba
Tikus Wistar ditempatkan didalam kandang, kemudian diadaptasikan selama satu
minggu dilaboratorium. Tikus Wistar diberi makan dan diganti setiap hari. Untuk
mencegah infeksi yang dapat terjadi kandang tikus dibersihkan setiap hari. Hewan coba
diletakkan dalam kandang yang jauh dari kebisingan. Setiap kandang diberi tabel berupa
nama kelompok, alas kandang diberi sekam dan diganti setiap dua hari, diberi tempat
makanan, dan botol yang ujungnya terdapat pipa untuk sedotan sebagai tempat minum
tikus (Jusuf, 2007)
4.9.2. Persiapan Bahan
a. Membuat ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus)
Akar rumput teki dibersihkan dan langsung dikeringkan dalam oven dengan suhu
37oC selama 24 jam. Setelah kering, akar rumput teki tersebut dipotong kecil-kecil dan
diserbuk, kemudian diekstrak dengan etanol 95% selama 30 menit. Setelah itu dimaserasi
dalam etanol 95% selama 24 jam, lalu difiltrasi dengan corong Buchner dan diperoleh
filtrat. Filtrat yang diperoleh tersebut dievaporasi dengan rotary evaporator dengan suhu
40oC dan tekanan vakum dan diperoleh ekstrak kental sampai tidak menetes (Suganda
dan Ozaki, 1996; Kardoko dan Eleison, 1999 dalam Puspitasari et al.2003).
b. Membuat sediaan ekstrak akar rumput teki (berupa Gel)
Ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) diletakkan pda mortar panas. PEG 400
dan PEG 4000 dilelehkan dalam cawan porselin diatas penangas air dengan perbandingan
1:2, setelah cair atau leleh, basis dituang dalam ekstrak akar rumput teki (Cyperus
Rotundus) dan diaduk sampai homogen. Kemudian ditambah sisa basis sedikit demi
sedikit sesuai konsentrasi 2%, 4%, dan 8 % kemudian diaduk sampai terbentuk massa gel

yang halus dan homogen. Kemudian gel dikemas dalam wadah tertutup rapat
(Damaiyanti, 2011)
4.9.3. Perlakuan Pada Hewan Coba
1. Pembuatan Ulkus
Sebelum mendapat perlakuan, semua hewan coba diberikan anestesi inhalasi agar
hewan coba tidak mengalami rasa sakit pada perlakuan awal. Kain yang telah dibahasi
larutan ether 10% diberikan kepada hewan coba, kemudian ditutup rapat dan ditunggu
sampai tertidur. Mukosa bibir bawah tikus dioleskan dengan clorhexidinedigluconate
0,12%. Kemudian mukosa bibir bawah tikus dilukai dengan burnisher no.4 dengan
penampang 2 mm yang telah dipanaskan selama 1 menit dan disentuhkan ke mukosa
mulut tikus wistar selama 1 (Damaiyanti, 2012)
2. Teknik Aplikasi Gel Ekstrak Akar Rumput Teki (Cyperus Rotundus)
Gel ekstrak akar rumput teki (Cyperus Roundus) dengan konsentrasi 2%, 4 %, dan 8
% disiapkan. Gel ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) yang diaplikasikan ke
ulser adalah sebanyak 0,045 mg untuk masing-masing kelompok perlakuan (Yulianto,
2008). Pada hari ke 3. Setelah perlakuan, aplikasi topical gel ekstrak akar rumput teki
(Cyperus Rotundus) diberikan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Cavalcante 2011,
bahwa ulser pada umumnyaterjadi pada hari ke 1-3 setelah hewan coba diberi perlakuan.
Oleh karena itu aplikasi gel diberikan pada hari ke tiga. Aplikasi pada kelompok A,B,C
dan Ddilakukan 1 kali sehari pada hari ke 3 setelah perlakuan hingga hari ke empat
(Damaiyanti,2012)

3. Tahap Euthaniasia Hewan Coba

Tikus perlakuan dan tikus kontrol dikorbankan pada hari 4 setelah perlakuan
pembuatan ulkus traumatikus. Pembunuhan tikus diletakkan dalam tabung kaca dan
dengan menggunakan eter dalam dosis letal. Kemudian mukosa bibir bawah dipotong
sampai sudut mulut tikus mengikutkan bagian yang ulser dan bagian yang normal
dimasukkan dalam larutan fiksasi dan selanjutnya tikus yang telah mati dikubur

(Damaiyanti,2012)
4. Tahap Pembuatan Sediaan
Persiapan pembuatan preparat histology diawali dengan memotong mukosa bibir
bawah tikus dengan mengikutkan jaringan normal tikus. Kemudian dilanjutkan teknik
proses jaringan dengan metode parafin (Sudian, 2004)
5. Tahap Perlakuan Dengan Metode Paraffin
a.

Mukosa bibir bawah tikus dipotong pada 4 hari setelah perlakuan, kemudian
direndam dalam butterformalin 10 % (pH 7,4)

b.

Fiksasi dilakukan 2 tahap, setelah 48 jam pertama larutan fiksasi diganti yang baru
dan pada tahap kedua dibiarkan dalam larutan fiksasi selama 48 jam (ketebalan
jaringan 0,5 cm). Fiksasi dilakukan untuk menghentikan proses autolisis pada sel
yang disebabkan oleh perlakuan selanjutnya. Setelah dilakukan fiksasi jaringan
dibilas dengan air mengalir selama 6-9 jam

c.

Tahap selanjutnya adalah dehidrasi I untuk mengekstrasi air dari jaringan dan alkohol
dengan konsentrasi 80 % selama 1 jam, alkohol 95 % 2 kali 1 jam dan alkohol 100%
(absolut) 3 kali 1 jam

d.

Kemudian dilakukan penjernihan atau clearing I dengan cara memasukkan kedalam

larutan Xylene 2 kali 0,5-1 jam. Pada 10 menit terakhir proses clearing itu dinaikkan
sampai 62C dengan memasukkan kedalam inkubator (Sudiana,2004)

e.

Proses berikutnya adalah dilakukan infiltrasi I pada jaringan. Infiltrasi pertama ini
dilakukan tidak lebih dari 5 menit. Kemudian setela selesai infiltrasi I, jaringan
dicelupkan kedalam xylene selama 2-3 menit. Kemudian dimasukkan kedalam
alkohol 95 % selama setengah jam, dicuci dengan air mengalir selama 1-2 jam
(sudiana 2004)

f.

Setelah proses infiltrasi dilakukan kembali proses dehidrasi II dan clearing II cara
sama seperti dehidrasi I dan clearing I. Kemudian dilakukan infiltrasi II yaitu dengan
cara mencelupkan jaringan kedalam paraffin yang telah dicairkan pada suhu 62C,
selama 1,5 jam sebanyak 2 kali (sudiana, 2004)

g.

Tahapan selanjutnya adalah embedding. Disini jaringan ditanam kedalam balok

parafin, caranya paraffin cair dituangkan kecetakan yang dibentuk dari 2 logam yang
disusun membentuk kotak yang diberi alas lembaran logam
h.

Segera setelah paraffin cair dituangkan kecetakan, potongan jaringan dimasukan

memakai alat pingset dengan arah permukaan jaringan yang akan diposting
menghadap ke dasar bagian atas diberi label tanda. Setelah paraffin mengeras
selanjutnya logam cetakan dapat dilepas (Sudiana, 2004)

i.

Tahapan terakhir adalah pemotingan yang dilakukan dengan rotary microtome secara
serial dengan ketebalan 5 . Selama waktu pemotongan suhu blok diusahakan rendah
5-10C, hal ini diusahakan dengan mendinginkan blok dan pisau pemotong dengan
air es. Gunanya agar sediaan tetap basah dan yang tertanam blok dapat terpotong
dengan baik. Dari potongan-potongan ini dipilih yang bagus kemudian dimasukkan
kedalam water bath

j.

Sayatan jaringan ditempelkan pada gelas objek kemudian siap diwarnai (Sudiana,
2004)

4.10. Teknik Pembuatan Preparat Histometri

a.

Teknik yang dilakukan adalah pengecatan HE (hematoxilineosin)

b.

Mencelupkan slide kedalam larutan xylol selama 2 jam sebanyak 2 kali, etanol
absolute selama 1 jam sebanyak 2 kali, setanol 95 % selama 1 jam sebanyak 2 kali,
etanol 80 % selama 1 jam

c.

Dicuci dengan air 10-15 menit

d.

Dimasukkan kedalam larutan mayers haemotoksilin selama 15 menit untuk

mewarnai inti sel, dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kelebihan cat
selama 20 menit

e.

Pengecatan dengan lithium karbonat, slide dimasukkan kedalam lithium karbonat

selama 1-2 menit agar didapatkan inti yang membiru, dicuci dalam air mengalir
selama 5-10 menit

f.

Pengecatan dengan eosin yaitu dengan memasukkan slide kedalam larutan eosin
selama 15 detik-2 menit, tujuan tahap ini untuk memberi pewarnaan pada
sitoplasmanya (Sudiana,2004)

g.

Proses berikutnya adalah dehidrasi yaitu dengan memasukkan slide ke dalam etanol

95% selama 2 menit sebanyak 2 kali dan etanol absolute selama 2 menit sebanyak 3
kali.
h.

Tahap terakhir adalah mounting. Sediaan ditetesi entellan kemudian ditutup dengan
gelas penutup dan siap dilakukan pemeriksaan dibawah mikroskop cahaya hasil yang
didapatkan adalah inti berwarna biru dan sitoplasma sel berwarna merah (Sudiana,
2004)

4.11. Tahapan Pengambilan Data

Jumlah monosi ditentukan berdasarkan pengamatan preparat histometri blok paraffin
dibawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400x. Perhitungan sel dilakukan dengan
cara graticulae yang membagi bidang visual dari mikroskop cahaya dalam ukuran tertentu
agar untuk memudahkan membaca dan mencegah duplikasi sel. Data diperoleh dari
hitungan rata-rata dalam lima bidang visual dalam graticulae tersebut (ratna, 2005).
4.12. Analisis Data
Data penelitian yang telah diperoleh terlebih dahulu diuji normalitasnya
menggunakan

uji

Kolmogorov-smirnov

dan

di

uji

Levene

untuk

menguji

homogenitasnya. Data penelitian yang terdistribusi normal (p > 0,05), dilanjutkan dengan
uji parametrik menggunakan Twoway Anova dengan tingkat kepercayaan 95% (=0,05)
(Notoatmojo, 2002). Apabila terdapat perbedaan bermakna dilanjutkan dengan uji Tukey
HSD dan jika distribusi yang tidak normal maka dilakukan analisa data dengan
menggunakan uji Mann-Witney Test untuk mengetahui perbedaan pengamatan antara
perlakuan topikal gel ekstrak akar rumput teki (Cyperus Rotundus) dengan konsentrasi
2%,4 % dan 8% dengan kelompok kontrol pada pengamatan hari ke 4 (Sugiyono, 2014)
4.13. Alur Penelitian
Sampel tikus jennis Rattus norvegicus
strain wistar (tikus wistar)

Anestesi Topikal

Terjadi ulcerasi

Pemberian gel ekstrak akar

rumput teki (Cyperus Rotundus)
pada hari ke-3 (kelompok
perlakuan)
Tanpa perlakuan (kelompok kontrol)

Konsentrasi 2
%
Konsentrasi 4
%

Konsentrasi 8
%

dikorbankan

Diambil jaringan mukosa dan dibuat sediaan

Pewarnaan HE

Perhitungan jumlah monosit

hasil

Analisis data

pembahasan